花药培养与分子标记辅助选择相结合快速选育抗条纹叶枯病晚粳稻新品系的技术探讨

于凤池，姚 坚，姚海根，殷跃军

(浙江省嘉兴市农业科学研究院，浙江 嘉兴 314016)

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱为传毒媒介的病毒病，近年来，水稻条纹叶枯病在浙江省北部晚粳稻区呈快速上升趋势，对水稻安全生产构成了很大威胁［1］。花药培养在水稻育种上的应用始于20世纪70年代后期，由于它具有缩短育种年限、扩大变异范围等优点，在新品种培育、杂交水稻提纯复壮、新种质创制等方面得到了广泛应用［2－3］。分子标记辅助选择技术具有准确率高、不受生育期限制等优点，近年来在水稻育种中的应用越来越广泛，尤其在水稻抗性育种方面应用效果颇佳［4］。本研究结合花药培养和分子标记辅助选择技术，将抗条纹叶枯病主效基因和微效多基因快速聚合到晚粳稻品种中，以提高晚粳稻品种的条纹叶枯病的抗性。

1 材料与方法

1.1 材料

受体亲本:秀水09、秀水128、中间材料秀水132/GP15//丙05111等;抗条纹叶枯病供体亲本:镇稻 631、镇稻 413、秀水 114和中间材料丙00502/秀水123等。

1.2 条纹叶枯病田间抗性鉴定方法

采用大田自然发病鉴定。在条纹叶枯病重病区建立鉴定圃，鉴定圃不防治灰飞虱，于5月中旬播种，单本插，每份材料种植100株左右，8月底调查株发病率。

1.3 DNA提取及PCR技术

用于DNA提取的材料为大田水稻抗条纹叶枯病组合F1植株和花培后代苗期取回的嫩叶片。用于PCR反应的引物为 F-5′TAGCCATGCTCATGCGTCAT 3′;R-5′CGCGGTTTGCAGTAGTTGC 3′。引物由上海生物工程有限公司合成。PCR扩增反应总体积为 20 μL，其 中 包 括 10 × PCR buffer 2 μL，MgCl22 μL，dNTP 200 μmol·L－1，引物 F，R 各50 ng，基因组 DNA 1μL(约50 ng) 和1 U的 Taq DNA聚合酶。扩增程序如下:下预变性2 min，94℃下变性45 s，58℃下退火45 s，72℃下延伸1 min，35次循环，最后72℃下延伸5 min。

1.4 花药培养技术

经PCR检测含有抗条纹叶枯病基因的单株，在花药处于单核靠边期取样，采用一步成苗法进行花药培养。培养基基本成分为:N6大量和 MS微量，添加一定浓度的 NAA、2，4-D、甘氨酸、KT等，以及0.7%琼脂，5%蔗糖，pH值5.8。花药经过30～40 d的 (26±1)℃暗培养后，转入光照下 (每天12 h)进行分化培养，将分化出的绿苗转移到无激素和低糖浓度的壮苗培养基上进行壮苗培养后，移栽于大田。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

采用以上引物和反应程序进行PCR反应，并用3%的琼脂糖凝胶电泳，其中高抗对照品种为丙00-502，中抗品种为 XR278，高感品种为秀水09。根据电泳条带判断样品的抗感性，并结合田间抗性鉴定结果进行最终筛选。2008年秋对29个抗条纹叶枯病组合共计218个花培取样的F1植株检测，其中35个植株不含抗条纹叶枯病基因。

2.2 花药培养

分蘖期于含有抗条纹叶枯病基因的组合F1植株逐株取嫩叶作分子标记检测，淘汰不抗条纹叶枯病组合及植株。于抗条植株花药处于单核靠边期时取样接种。2007年春至2008年春3批接种培养晚粳稻组合共计69个，获得绿苗10 269株;嘉兴正季两年共获得花培鉴定株系363份。

3 抗条纹叶枯病晚粳稻新品系的选育

通过对不同组合花药培养后代材料进行条纹叶枯病分子标记检测、小区产量、农艺性状、品质及其它抗性鉴定，并在重病区进行条纹叶枯病自然发病鉴定。2007、2008年分别筛选到3份对条纹叶枯病抗性较好、其它综合性状良好的晚粳稻新品系，其中07HK23、08HK80参加了2008年浙江省晚粳育种攻关组联合品比，07HK75参加了2008年浙江省特早熟晚粳稻区试，其主要特征如表1所示。

表1 抗条纹叶枯病早熟晚粳稻的主要特征

4 抗条纹叶枯病常规晚粳稻新品种的高效快速选育程序

基于2年的育种实践，我们认为花药培养取样前，先对取样植株进行抗条纹叶枯病分子标记辅助选择，可以淘汰不含目标基因的组合和植株 (假杂种)，减少花药培养的工作量，使花培效率大大提高。对花药培养后代材料苗期进行抗条纹叶枯病分子标记检测可以达到早期选择的目的，缩小产量鉴定圃的规模，同时减轻其他鉴定的工作量，提高整个选育工作的效率。因此，我们建立了以下采用花药培养与分子标记辅助选择相结合选育抗条纹叶枯病晚粳稻新品种的程序 (图1)。

5 小结与讨论

图1 抗条纹叶枯病晚粳新品种的选育程序

虽然水稻花药培养已成为水稻育种的成熟手段，但仍存在不少技术难题与理论问题，其中最主要的问题是花药培养绿苗率低，白化苗较多，尤其是籼稻的绿苗率只有1.0% ～1.5%［5］;相比之下，粳稻绿苗率较高，一般可比籼稻高5～10倍，但不同亲本所配组合间差异很大。在本研究中，2007年上半年28个组合F1花培绿苗率平均为37.13%，变幅在4.84%～79.23%之间 (按管计算);全年2季42个粳稻组合共接种花药约14 000管，出愈率在75%左右 (按管计算);绿苗率在25%左右(按管计算)。

绿苗率的高低直接影响了花培育种的效率，而影响花药培养效率的因素是多方面的，既有内在因素 (材料的基因型)，也有外在因素 (外植体的发育程度、取材时期、培养基的组分、培养条件等)［6］。因此，在开展水稻花药培养育种时，首先需要解决花培的诱导频率，选择适宜培养的优良组合;探索和研究外植体的合适取材时期;选择最适的培养基组分，以及最合理的诱导和分化的培养环境。

分子标记辅助选择与花药培养相结合，应用于抗条纹叶枯病晚粳稻新品种的选育，提高了育种速度，缩短了育种年限，在本研究中从配组到获得稳定的抗条纹叶枯病新品系只化了2年时间 (每年嘉兴、海南2代)，可比常规育种缩短2年左右。随着现代生物技术的迅速发展，新型的分子标记不断涌现，花药培养力不断提高，该途径可望在其他的水稻育种实践中得到更广泛的应用。

［1］张国鸣，王华弟，戴德江.浙江省水稻条纹叶枯病发生发展态势与防控对策措施 ［J］.中国植保导刊，2006，26(7):20－21.

［2］倪丕冲.我国水稻花培育种及其应用 ［J］.农业科技通讯，1991，(5):5－6.

［3］李梅芳.水稻花培育种前景 ［J］.作物杂志，1991，(3):17－18.

［4］沈圣泉，舒庆尧，吴殿星，等.利用分子标记辅助选择育成抗螟虫籼稻不育系科龙 A［J］.杂交水稻，2008，23(2):15－18.

［5］柳美南，钟海明，陈绵桥，等.水稻花药培养及其应用［J］.现代农业科技，2008，(17):234－236.

［6］王兴春，杨长登，李西明，等.分子标记辅助选择与花药培养相结合快速聚合水稻白叶枯病抗性基因 ［J］.中国水稻科学，2004，18(1):7－10.