外阴恶性肿瘤中P21、ILK及HPV 6/11、HPV 16/18的检测及意义

李胜水 ，葛风芹 ，刘春在 ，许 华 ，李双标 ，张凤梅 ，刘 岩

(1.河北省沧州中西医结合医院病理科，河北沧州 061001；2.河北省沧州市传染病医院，河北沧州 061001；3.河北省南大港医院，河北沧州 061103)

研究表明，外阴多种病变与人乳头瘤病毒（HPV）感染有关，高危HPV感染则是引起外阴恶性肿瘤的重要原因之一[1]。在外阴恶性肿瘤的发生及发展过程中，HPV感染与P21、ILK蛋白过度表达是否存在一定的联系，目前国内文献报道较少。本研究通过免疫组化SP法及原位杂交法（ISH）检测P21、ILK及HPV 6/11、HPV 16/18在外阴恶性肿瘤、外阴上皮内瘤变（VIN）组织中的表达情况，进而综合分析在不同HPV感染的状态下，P21和ILK的表达与外阴恶性肿瘤发生、发展及预后的关系，有助于全面理解外阴恶性肿瘤的生物学特征，为临床诊断、治疗及判断预后提供有价值的生物学指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

标本取自1992～2009年沧州中西医结合医院因外阴病变而行手术切除的患者，入院后均行外阴广泛切除术加腹股沟盆腔淋巴结清扫术。外阴恶性肿瘤30例，其中，腺癌2例，基底细胞癌2例，外阴鳞癌26例（角化鳞癌21例，疣状鳞癌5例）；癌组织高分化11例，中分化12例，低分化7例；病理分级G119例，G26例，G35例；肿瘤直径≤2 cm者8例，＞2 cm者22例。全部病例术前均无放疗、化疗史；病程1～5年；年龄30～83岁，平均56.5岁。外阴上皮内瘤变（VIN）21例，其中，VINⅠ 6例，VINⅡ 8例，VINⅢ 7例；年龄30～71岁，平均55.5岁。10例正常皮肤组织为对照组，其中，5例为外阴手术阴性切缘，5例正常外阴组织；年龄35～87岁，平均61.0岁。所有标本均经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。

1.2 主要试剂

一抗分别为鼠抗人P21单克隆抗体，鼠抗人ILK单克隆抗体，HPV 6/11、HPV 16/18原位杂交检测试剂盒（含生物素标记的HPV 6/11、HPV 16/18探针）和SP试剂盒。以上试剂均购自福州迈新公司。

1.3 实验方法

P21及ILK检测采用免疫组化SP法；HPV 6/11及HPV 16/18检测采用原位杂交法。实验步骤严格按说明书进行。

1.4 结果判定

P21及HPV 6/11、HPV 16/18均显示细胞核着色，光学显微镜下见到细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性染色；ILK在细胞内的阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞质内，出现浅或棕黄（褐）色颗粒。评分方法：参照Fomwitz综合计分法并略加修改，行半定量分析：随机抽样在高倍镜下计数肿瘤细胞总数和阳性细胞个数，然后得出阳性细胞百分率，着色强度按多数阳性细胞呈现的染色程度分为4级：阴性（-），即阳性细胞数<1%，仅极个别细胞呈现轻度显色或者无显色；弱阳性（+），即阳性细胞数<10%且≥1%；强阳性（+++），即阳性细胞数>60%；中度阳性（++），即阳性细胞数介于弱阳性与强阳性两级之间。

1.5 统计学处理

数据经SPSS 10.0软件分析，用行×列联表χ2检验，各指标的相关关系用Spearman等级相关分析，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 P21及ILK在各组中的表达情况

P21在外阴恶性肿瘤组、VIN组中的阳性表达率显著高于正常组（P<0.05）；ILK在外阴恶性肿瘤组中的阳性表达率显著高于VIN组（P<0.05），其在外阴恶性肿瘤组和VIN组中的阳性表达率均显著高于正常组（P<0.05）。见表1。

表1 P21和ILK在各组中的表达（例）

2.2 HPV 6/11、HPV 16/18在各组中的感染情况

外阴恶性肿瘤组和VIN组中HPV 6/11阳性表达率均显著高于正常组（P<0.05）；HPV 16/18阳性表达率与正常组比较，有显著性差异（P<0.05）；VIN组与正常组比较，无显著性差异（P>0.05）。 见表 2。

表2 HPV 6/11、HPV 16/18在各组中的感染情况

2.3 HPV 6/11、HPV 16/18 与 P21、ILK 的关系

HPV 6/11、HPV 16/18感染组中P21、ILK的阳性表达与无感染组比较，无显著性差异（P>0.05）。见表3。

表3 HPV 6/11、HPV 16/18感染与无感染者P21、ILK的检测（例）

2.4 P21与ILK、HPV 6/11、HPV 16/18的检测与外阴恶性肿瘤的临床病理特征及其相互关系

P21、ILK和HPV 6/11、HPV 16/18的阳性表达率与肿瘤大小、组织类型、鳞癌的病理分级、临床分期及淋巴结是否转移无关（rs=-0.022，P>0.05）。 HPV 6/11、HPV 16/18 与 ILK 和P21 的表达无相关性（rs=-0.020，P>0.05），ILK 与 P21 的表达也无相关性（rs=-0.015，P>0.05）。

3 讨论

p21基因是CIP家族中的一员，它是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子。p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站，因DNA损伤后不经过修复则无法通过，减少了受损DNA的复制和积累，从而发挥抑癌作用[2-3]。p21可以通过细胞周期调控作用间接参与细胞凋亡（依赖p53途径）和直接导致细胞异化恶变（非依赖p53途径），可以正性调节细胞依赖性激酶功能，抑制PCNA与多聚酶γ结合，影响DNA复制和抑制应激蛋白激酶活性，可作为肿瘤分化程度及临床分期的参考指标之一[4]。

ILK是新近发现的一个具有3个结构单位的Ser/Thr蛋白激酶，作为整合素和生长因子受体信号传导途径中的一个重要效应物，ILK调节着细胞的黏着、生存、分化和凋亡[5]。其相关蛋白PKB、GSK3等是细胞程序性死亡和细胞周期循环的重要调节蛋白[6-7]。这些原因使得ILK与肿瘤的形成、浸润、转移和临床预后等密切相关。目前，ILK的功能紊乱在肿瘤发生中的作用仍有大量的理论问题有待解决[8-12]。

本研究结果表明，在各级VIN中均有P21及ILK表达，且阳性产物定位于非典型区，推测在异常细胞增殖的转化过程中，已有ILK及p21基因的扩增，并可通过蛋白水平检测出来。ILK在外阴恶性肿瘤中的阳性表达率明显高于VIN组，表明从外阴恶性肿瘤癌前病变到浸润癌的发展过程中ILK起重要的作用；而P21在外阴恶性肿瘤组与VIN组中的阳性表达率相似，推测在外阴恶性肿瘤的发展过程中P21的检出可能是一个早期事件。

本研究结果显示，P21及ILK阳性表达与外阴恶性肿瘤的临床分期、组织学分级、肿瘤的大小及淋巴结是否转移均无关，提示在外阴恶性肿瘤中，P21和ILK的过度表达可能只对细胞转化及恶性表型的维持有重要作用，而与外阴恶性肿瘤的预后无关。P21与ILK表达无相关性，推测在外阴恶性肿瘤中ILK的表达可能还受其他因素的影响。约1/3的外阴恶性肿瘤与HPV感染有关，在小于35岁的妇女中HPV感染率高达85%。本研究结果表明，在外阴恶性肿瘤及VIN组织中存在一定比例的HPV 6/11及HPV 16/18感染，推测HPV感染在外阴恶性肿瘤的发生及发展中起一定作用。同时，本研究结果显示，HPV 6/11、HPV 16/18 感染与 P21、ILK的表达无关。

总之，外阴组织的癌变是受多种因素作用的，笔者认为通过降低HPV感染率，对P21、ILK蛋白表达阳性的癌前病变积极干预，可以遏制细胞的持续转化，从而在一定程度上阻止外阴恶性肿瘤的发生及发展。

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