急性ITP患儿外周血Tr细胞及其与IL-2的相关性研究①

宋 丽 金呈强 刘 仿 杜宁超 肖 红 (广东医学院微生物与免疫教研室,湛江524023)

CD4+CD25+Foxp3+T调节性T细胞(regulation T cell,Tr细胞)是维持机体免疫耐受的重要调控者,在自身免疫病中的作用已引起关注。急性特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患儿外周血中Tr细胞数量的减少及相关细胞因子(IL-10、TGF-β)含量的降低,与急性ITP患儿的细胞免疫失调有关。而IL-2是Th1类细胞因子,IL-2能否促进或抑制Tr细胞的增殖尚未见报道。为探讨ITP患儿Tr细胞数量受细胞因子IL-2的影响状况,我们用流式细胞术和ELISA法分析患儿外周血中Tr细胞及细胞因子IL-2的变化。

1 材料及方法

1.1 研究对象 35例急性ITP患儿系广东医学院附属第一医院和附属湛江中心医院住院病人,急性ITP患儿均符合急性ITP诊断标准,正常对照为30例健康体检者,详细情况见表1。

1.2 试剂和仪器 PerCp-抗人CD3 mAb,FITC-抗人CD4 mAb和APC-Cy7-抗人CD8 mAb,流式细胞检测试剂均购自BD公司。鼠抗人IL-2mAb(mAHuIL-2)为Biosource公司产品。流式细胞仪为美国BD公司产品(型号:FACSCanto),酶联仪为 Biotek公司ELX800型。

1.3 方法

1.3.1 外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞检测 取未刺激的外周肝素抗凝全血50μl后加入10μl的CD4-FITC与CD25-APC cocktail,并于4℃下避光孵育30分钟以标记CD4+CD25+T细胞;经溶血洗涤后使用1 ml Fixatior/Perm缓冲液穿膜45分钟,而后用洗涤缓冲液洗涤后加入1μl正常鼠血清于4℃封闭15分钟,之后直接加入 10μl PE-抗人 Foxp3 mAb,于4℃避光孵育30分钟。经洗涤缓冲液洗涤2次后用300μl染色缓冲液重悬并上FACSCanto流式细胞仪检测。

1.3.2 IL-2的检测 患儿和健康儿童肝素抗凝血5 ml,室温静置 30分钟后,离心分离血浆冻存于-70℃。同批用ELISA法分别测IL-2的含量。

1.4 统计学处理 全部数据均经SAS 8.22统计软件分析。数据用±s表示,两变量的相关程度用直线相关分析法,以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 急性ITP患儿及正常对照儿童组外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量及IL-2的检测 结果见表2、3。ITP患儿外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞显著低于对照组(t=2.19,P＜0.05),CD4+CD25+Foxp3+T细胞在总CD4+T细胞中所占比例也低于对照组(χ2=74.08,P＜0.05),急性 ITP组IL-2含量明显低于对照组[(45.62±9.35)pg/ml VS(28.38±13.87)pg/ml,t=9.05,P＜0.01)]。

表1 急性ITP组和正常对照组一般资料比较Tab.1 The contrast data of acute ITP with normal group

表2 急性ITP组与对照组外周血T细胞亚群及IL-2比较(±s)Tab.2 The contrast of T cell′s subpopulation and IL-2 in blood between acute ITP and contrast group(±s)

表2 急性ITP组与对照组外周血T细胞亚群及IL-2比较(±s)Tab.2 The contrast of T cell′s subpopulation and IL-2 in blood between acute ITP and contrast group(±s)

Note:1)P＜0.05.

Groups n CD4+T cell(%)Tr cell/CD4+T cell IL-2(pg/ml)Acute ITP 35 27.37±5.591)0.11±0.041)28.38±13.871)Control group 30 35.32±2.27 0.15±0.02 45.62±9.35

表3 急性ITP组与对照组外周血T细胞亚群及Foxp3的比较Tab.3 The contrast of T cell′s subpopulation and Foxp3 in blood between acute ITP and contrast groups

图1 急性ITP患者血浆IL-2含量与Tr细胞的相关性分析Fig 1 The pertinency analysis between IL-2 and Tr cell in plasama of ITP

2.2 CD4+CD25+Foxp3+T细胞与细胞因子IL-2的相关性 急性ITP组外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞所占CD4+T细胞的比例与IL-2的水平呈正相关(r值为0.86,P＜0.05)见图1。

3 讨论

急性特发性血小板减少性紫癜是儿童常见的一种免疫性出血性疾病,发病机制不明,迄今尚无特异而有效的治疗方法。近年来研究发现,细胞免疫在ITP的发病机制中扮演着极其重要的角色。ITP患者体内可检测到自身反应性CD4+T细胞,这些T细胞能辅助B细胞产生针对血小板表面糖蛋白的自身抗体[1],CD4+自身反应性T细胞的异常激活是ITP发病机制的始动环节之一[2]。另外发现急性ITP患者中Th1细胞增多、Th2细胞减少,反映Th1细胞功能的细胞因子(如IL-2、INF-γ、IL-6和血清可溶性IL-2受体sIL-2R)血浆水平明显升高[3],而与Th2细胞功能密切相关的细胞因子IL-4和IL-6水平则明显降低,证实ITP是一种Th1优势的自身免疫病[4,5]。CD4+CD25+Treg细胞为一种自然发生的、胸腺来源的T细胞,是一种具有免疫抑制功能的T细胞亚群,该细胞能抑制自身反应性T、B细胞的活化和增殖,以及自身抗体的产生,CD4+CD25+调节性T细胞在维持机体自身免疫耐受中发挥重要作用。Tr细胞的数目减少或功能失调均可引起自身免疫性疾病[6]。最新的研究表明,在急性和慢性难治复发性的ITP患者外周血中,调节性细胞的数量显著低于缓解的患者和健康志愿者,且该细胞的抑制功能也明显出现障碍,证实调节性T细胞的数目减少和功能缺陷可能为ITP免疫紊乱的参与机制之一[7,8]。另外,急性ITP患儿外周血中Tr细胞数量减少,CD4+CD25+T细胞相关性细胞因子IL-10、TGF-β的表达水平也降低,IL-7则对Tr细胞数量的变化产生一定的影响[9,10]。Tr细胞活化后分泌大量的IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子,其功能通过这些抑制性细胞因子来实现[11]。

IL-2主要由T细胞或T细胞系产生。目前关于IL-2的生物学作用大都是体外实验的结果。IL-2具有以下生物学作用:①Th和Tc细胞都是IL-2的反应细胞:IL-2对静止T细胞作用较弱。胸腺细胞和T细胞经抗原、有丝分裂原或同种异体抗原刺激活化后有在IL-2存在的条件下进入S期,维持细胞的增殖。IL-2可刺激T细胞转铁蛋白受体(TfR,CD71)、胰岛素受体、MHCⅡ 类抗原的表达,并产生多种淋巴因子如 IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-β及 CSF等。②诱导CTL、NK和LAK等多种杀伤细胞的分化和效应功能,并诱导杀伤细胞产生 IFN-γ、TNF-α等细胞因子。IL-2可增强CTL细胞穿孔素(perforin)基因的表达。③直接作用于B细胞,促进其增殖、分化和Ig分泌。已发现IL-2R也可存在于活化的B细胞中,IL-2对B细胞的调节作用除通过刺激T细胞分泌B细胞增殖和分化因子外,还可能有直接的调节作用。④活化巨噬细胞。但IL-2对Tr细胞的作用至今尚未见文献报道。

以上研究表明,ITP患儿外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞显著低于对照组(t=2.19,P＜0.05),CD4+CD25+Foxp3+T细胞在总CD4+T细胞中所占比例也低于对照组(χ2=74.08,P＜0.05),急性ITP组IL-2含量明显低于对照组[(45.62±9.35)pg/ml VS(28.38±13.87)pg/ml,t=9.05,P＜0.01)]。他们含量的减少使有效的免疫抑制作用降低,导致自身反应性T细胞激活增多、凋亡减少,促进了血小板的破坏。

1 Kuwana M,lkeda Y.The roleof autoreactive T-cells in the pathogenesis of idiopathic thromboeytopenic purpura[J].Int J Hematol,2005;81:106-112.

2 Culic S,Labar B,Marusic A et al.Correlations among age,cytokines,lymphocyte subtypes,and platelet counts in autoimmune throm2 bocytopenic purpura[J].Pediatr Blood Cancer,2006;47(5):671-674.

3 肖爱芹,唐先格,杨宪勇 et al.T淋巴细胞PKC在急性ITP发病中的作用[J].山东医药,2007;47(25):34-35.

4 Panitsas F P,Theodoropoulou M.Adult chronic idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP)isthe manifestation of a type-1 polarized immune response[J].Blood,2004;103:2645-2647.

5 Chang-Lin WU,Jian-Cheng X U,Fang L I et al.Polarization and apoptosis of T cell subsets in idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Int JLab Hematol,2007;29(3):177-184.

6 Anna landina,Sandrine Lecart,Dartevelle P et al.Functionaldefect of regulatory CD4+CD25+T cells in the thymus of patients with autoimmune myastheniagravis[J].Blood,2005;105:735-741.

7 James N George.Evaluation and management of patients with thrombotic thrombocytopenic purpura[J].Journal of Intensive Care Medicine,2007;22(2):82-91.

8 Liu B,Zhao H,Poon M C et al.Abnormality of CD4+CD25+regulatory T cells in idiopathic thrombocytopenic idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Eur JHaematol,2007;78:139-143.

9 汪宝贯,郭永建.人类血小板抗原与新生儿同种免疫血小板减少症[J].上海医学,2007;30(5):378-379.

10 金呈强,刘 仿,宋 丽 et al.急性ITP患儿外周血CD4+CD25+Foxp3+Tr细胞、IL-7水平变化及意义[J].山东医药,2009;49(11):4-6.

11 吕学文,刘 仿,伍昌林 et al.急性ITP患儿外周血CD4+CD25+T细胞及相关细胞因子的研究[J].临床检验杂志,2007;25(2):104-106.

12 Verma N D,Plain K M,Nomura M et al.CD4+CD25+T cells alloactivated ex vivo by IL-2 or IL-4 become potentalloantigen-specific inhibitors of rejection with different phenotypes,suggesting separate pathways of activation by Th1 and Th2 responses[J].Blood,2009;113(2):479-87.

13 Struski S,Gervais C,Helias C et al.Stimulation of B-cell lymphoproliferations with CpG-oligonucleotide DSP30 plus IL-2 is more effective than with TPA to detect clonal abnormalities[J].Leukemia,2009;23(3):617-619.

14 Camargo J F,Quinones M P,Mummidi S et al.CCR5 expression levels influence NFAT translocation,IL-2 production,and subsequent signaling events during T lymphocyte activation[J].Immunol,2009;182(1):171-182.