抗纤复方含药血清对HSC-LI90细胞Ⅰ型、Ⅳ型前胶原、基质金属蛋白酶组织抑制因子1 mRNA表达影响的研究

李 晶 赵 钢

抗纤复方是临床治疗肝纤维化的有效药物，由黄芪、丹参、紫河车、郁金等药物组成[1]。以往的实验研究表明，该药不仅能够抑制肝内多种细胞外基质的合成，而且能够抑制肝纤维化大鼠肝星形细胞TGFβ1的表达，减少胶原产生[2，3]。我们为了研究该复合方剂抗肝纤维化作用机制，以不同剂量抗纤复方含药血清进行实验室研究，以Northern 印迹杂交方法进一步观察抗纤复方对HSC-LI90细胞I型（CoL-I）、IV型前胶原（CoL-IV）、基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 抗纤复方的制备

其无菌制剂由上海曙光医院制剂中心制备，以蒸馏水分别稀释成0.025、0.05、0.10、0.3g/mL等不同浓度。

1.2 细胞系

星形细胞系HSC-LI90由日本佐贺医科大学肝病中心惠赠，系表型为活化的人肝星形细胞（HSC），表达高水平的CoL-I、MMP-II、TIMP-l、TGFβ1mRNA等[4]。

1.3 动物

用于制备含药血清的大鼠，清洁级，雌雄各半，体质量300～350g，购自上海中医药大学实验动物中心。

1.4 抗纤复方含药血清的制备

大鼠随机分为5组，每组5只，其中4组按体质量灌胃给予抗纤复方水溶液1.0mL/100g体质量，2次/d，剂量依次为0．5、2.0体质量、4.0g/kg体质量，于给药后90min分别以1.5%的苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，无菌条件下，从腹主动脉采血约10mL，存放于4℃冰箱中，待血浆凝固血清析出后，于高速离心机中以3000rpm离心10min，留取血清。另设一组作为空白对照组。所有血清均经56℃、30min灭活后，置-20%冰箱中保存备用。

1.5 细胞培养

HSC-LI90细胞以1×106细胞/100mm的浓度接种于培养皿，24h后，分别加入10%抗纤复方含药血清10mL，同时设空白对照组。培养48h后，提取细胞总RNA，检测HSC-LI90细胞I型、IV型前胶原、TIMP-1mRNA表达。

1.6 CoL-I 、CoL-IV 、TIMP-1 mRNA的Northern印迹杂交

运用AGPC法，从HSC-LI90细胞中提取总RNA。每20μg总RNA加入1%琼脂糖凝胶中，电泳后，将变性的RNA转移至硝酸纤维素滤膜（AmershamJapan）然后用32P-dCTP标记的cDNA探针与之杂交16h，杂交浓度65℃，洗膜2次以后，放射自显影。定量用BAS2000测定分析。用CoL-I（CoL-III、TIMP-1）/GAPDH的比值表示CoL-I、CoL-III、TIMP-1表达水平。每项实验至少重复3次，数据用mean±SD表示，用单因素方差分析进行统计学处理。

2 结 果

不同浓度的抗纤复方含药血清均有降低CoL-I、CoL-IV、TIMP-1 mRNA水平的作用，并呈一定剂量依存关系，统计学处理P＜0.05或0.01，结果见图1。

图1 抗纤复方含药血清CoL-I、CoL-IV 、TIMP-1 mRNA的影响

3 讨 论

肝纤维化为诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学变化，是影响肝病预后的重要环节，在尚无有效方法根治原发疾病的情况下，减缓或阻止肝纤维化的进程，是相当重要的治疗对策。 肝纤维化、肝硬化的病理基础是细胞外基质在肝脏异常的沉积，这种异常的沉积，和（或）胶原合成、降解的动态平衡失调有关。研究肝纤维化的发生、发展及其治疗对策时，应对细胞外基质合成和降解两方面同时加以观察，凡是能够影响胶原合成及/或胶原降解代谢的手段，都是阻断和逆转肝纤维化和肝硬化的有效方法[5]。

肝星形细胞是ECM的主要来源，肝星形细胞激活并转化为肌纤维样细胞，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下，肝星形细胞处于静止状态，当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星形细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星形细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。肝星形细胞的激活是肝纤维化发生、发展的关键环节。肝（HSC）是肝脏间质细胞之一，是肝纤维化时细胞外基质（ECM）过多产生和沉积的主要细胞来源[6]。针对HSC活化的不同环节进行抗肝纤维化治疗已形成了共识，如果能够抑制胶原等细胞外基质的合成和（或）促进ECM的降解，则有可能缓解、阻止甚至逆转肝纤维化、早期肝硬化。

肝星形细胞HSC-LI90系表型为活化的人星形细胞，表达高水平的CoL-I、MMP-2、TIMP-1 mRNA等，HSC-LI90是体外研究肝纤维化发生机制、观察抗肝纤维化药物作用的较为理想的模型[4]。我们采用中药组方抗纤复方取其不同浓度的含药血清观察了其对HSC-LI90细胞mRNA表达的影响。

Ⅰ型、Ⅳ型胶原是纤维化时病变部位沉积的主要胶原蛋白，Ⅵ型胶原是肝基底膜的主要成分，肝纤维化时含量明显增高，血中Ⅵ型胶原的水平与肝纤维化程度成正相关。在实验性肝纤维化模型中，Ⅰ型、Ⅳ型胶原mRNA表达增强，导致其产物过度沉积，Ⅰ型、IV型胶原mRNA在一定程度上可以反映ECM的沉积。我们实验结果表明，抗纤复方可明显降低HSC-LI90细胞I型、Ⅳ型胶原mRNA表达水平，从而减少胶原的沉积。

TIMP-1是一种糖蛋白，是ECM主要结构蛋白降解特异酶MMPS的抑制剂，肝纤维化时间质胶原酶活性下降而TIMP-1的表达增加，且与PⅢP、LN正相关，与肝纤维化程度相关。其主要作用是抑制MMP酶原的活化及其对ECM的降解，血清TIMP-1水平反映了慢性肝病肝内炎症和纤维化的一些重要特征，在目前情况下，是一种肝纤维化无创诊断和随访指标。TIMP-1是抑制基质金属蛋白酶活性的一组多功能因子家族的主要成员之一，能结合除14、19以外的所有MMPs而使其活性减弱，是肝纤维化发生过程中的一个非常重要的促发因素。许多实验研究表明，肝损伤激活HSC，表达MMPs和TIMPs，在肝损伤早期阶段，体外培养的HSC一过性表达MMP3、MMP13等，之后，HSC表型发生变化，前MMP2和MT-MMP表达，MMP2活化，降解局部正常的肝脏基质；并且TIMP-1表达明显，抑制间质胶原酶（MMP1/MMP13）对胶原的降解。而在肝损伤停止后，TIMP-1迅速减少，胶原酶活性增加，降解ECM，纤维化逆转[7]。可以证明，TIMP-1在调节胶原的降解代谢中发挥着重要的作用。通过研究我们认为不同浓度抗纤复方含药血清作用HSC-LI90细胞48h后0.5、2.0、4.0g/kg含药血清有降低 TIMP-1 mRNA水平的作用，提示抗纤复方具有促进胶原降解的作用。

抗纤复方可明显降低HSC-LI90细胞CoL-I、CoL-IV、TIMP-1 mRNA表达水平，从而干预肝纤维化及肝硬化时的胶原合成、降解代谢，发挥其抗肝纤维化的作用。

[1]Wang LT, Zhang B, Chen JJ.Effect of Anti-fibrosis compound prescription on collagen expression of hepatic cells of experimental liver fibrosis of rat[J].World J Gastroentrol,2000, 12:877-880.

[2]张斌,王灵台,陈建杰.抗纤复方影响大鼠肝贮脂细胞生成I、III型胶原的比较研究[J].中国实验方剂学杂志,2000,6:33-35.

[3]王灵台,张斌,陈建杰.抗纤复方药物血清对肝纤维化大鼠肝细胞生成胶原的影响[J].中华消化杂志,1999,19:391-393.

[4]Ozaki I, Zhao G.Hepatocyte growth factor induces collagenase via the transcription factor Ets-1 in human hepatic stellatc cell line[J].J Hepatol,2002,36:169-178.

[5]王宝恩.肝纤维化[J].中华肝脏病杂志,2000,8(4):179.

[6]王宝恩.肝纤维化时细胞外基质的合成与降解[J].中华肝脏病杂志,1997,5(2):65.

[7]Benyon RC,Arthur MJ.Extracellular matrix degradation and the role of hepatic stellate cell[J].Semin Liver Dis,2001,21(3):373.