反相高效液相色谱法测定犬血浆中靛玉红的质量浓度

童立年

(浙江省舟山医院，浙江 舟山 316000)

靛玉红是从中药青黛中提取的双吲哚类化合物，对慢性粒细胞白血病具有明显的抑制作用[1-3]，具有临床疗效可靠、毒副作用小、对骨髓无明显抑制作用等特点。笔者以非那雄胺为内标，建立了灵敏的反相高效液相色谱法测定Beagle犬血浆中靛玉红的含量，旨在为靛玉红的药代动力学研究奠定基础。

1 仪器与试药

2010 C型高效液相色谱仪(日本岛津);BP 210 S型万分之一电子天平(德国赛多利斯);TGL 216 C型台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂);XW-80型旋涡混合器(上海医科大学实验仪器厂)。靛玉红对照品(中国药品生物制品检定所);非那雄胺(武汉合中化工生物有限公司);甲醇(色谱纯，美国Fisher公司);水为重蒸水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

称取靛玉红对照品及非那雄胺适量，分别用二甲基亚砜(DMSO)和甲醇溶解制备成约含靛玉红80 mg/L及非那雄胺100 mg/L的对照品贮备液，将上述两种溶液贮存于-4℃冰箱中，临用前用甲醇稀释至所需质量浓度。

2.2 血样制备与测定方法

精密量取Beagle犬血浆样品0.5 mL，加入甲醇50 μL及内标非那雄胺甲醇溶液50 μL，旋涡混匀，加入混合溶剂正庚烷-乙醚(75 ∶25，V/V)3.5 mL，旋涡 5 min，以 10000 r/min 离心 5 min。分取有机相于另一离心管中，于50℃水浴中以氮气流吹干。残渣用100 μL流动相复溶，旋涡 3 min，以 10000 r/min离心 2 min。取上清液20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，以内标法计算血浆中靛玉红的质量浓度。

2.3 色谱条件与专属性考察

色谱柱:Hypersil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);检测波长:286 nm;流动相:0.1 mol/L的醋酸铵(含0.5%冰醋酸)-甲醇(25∶75);流速:1 mL/min;柱温:35℃。在此条件下，靛玉红出峰时间在11 min左右，内标出峰时间在6 min左右;主峰和内标峰峰形良好，相邻物质峰间可完全分离(R＞1.5)，血浆中内源性成分对测定无干扰，满足样品分析检测要求。色谱图见图1。

2.4 分析方法验证

图1 高效液相色谱图

线性范围、检测限及定量限:取0.5 mL空白犬血浆，分别加入不同质量浓度的靛玉红对照品溶液和内标溶液50 μL，使每1 mL血浆中分别含靛玉红 0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 μg/mL，混匀后依法萃取、测定，记录色谱图。以峰面积比(A样/A内)为纵坐标、靛玉红质量浓度 C(g/mL)为横坐标进行线性回归，得标准曲线方程 Y=1.013 X+0.027，r2=0.9997(n=7)。结果表明，靛玉红质量浓度在0.010～0.800 μg/mL范围内与峰面积比线性关系良好，最低检测限为5 ng/mL(S/N≥3)，最低定量限为10 ng/mL。

萃取回收率:取空白犬血浆0.5 mL，依法分别配制成高、中、低3 种质量浓度(0.400，0.100，0.025 μg/mL)的靛玉红血浆样品(C r)，按2.2项血浆样品制备法处理后进样3次，测得峰面积，并求出各质量浓度下3次进样的峰面积均值 A r。另取高、中、低已知质量浓度(C s)的靛玉红对照品甲醇溶液，氮气挥干，加入100 μL流动相溶解后进样20 μL测定，得峰面积 A s。以前后两种处理测定得到的对照品峰面积之比(A r/A s)计算萃取回收率。结果平均萃取回收率为71.65%，RSD为6.78%(n=9)。

精密度及方法回收率:取空白犬血浆0.5 mL，分别配制高、中、低3种不同质量浓度的血浆样品，照2.2项下方法分别在同一日内测定5次和每日5次连续测定3 d，考察日内、日间精密度和回收率。结果见表1。

表1 精密度和方法回收率试验结果(n=5)

样品稳定性:取空白犬血浆0.5 mL，分别配制高、中、低3种不同质量浓度(0.400，0.100，0.025 μg/mL)的血浆样品，于冰箱 -20℃放置，在不同时间取样，按2.2项下方法进行稳定性考察。结果血浆样品中靛玉红在15 d内稳定。

3 讨论

关于靛玉红血药浓度的测定方法文献报道很少。李长玲等[4]采用放射性标记法，但操作复杂，设备要求高，且测定结果实为靛玉红及其代谢产物的放射性之和。李珂佳等[5]用丙酮直接沉淀蛋白的方法对大鼠血浆中靛玉红质量浓度进行了测定，但定量限为0.025 μg/mL。笔者所建立的反相高效液相色谱法，通过对犬空白血样的干扰分析、内标物质的选择以及色谱条件与操作方法的研究，提高了灵敏度，方法学考察结果显示能满足生物样品测定的要求，这为靛玉红进一步的药代动力学研究奠定了基础。

[1]刘 佳，曾 琛，胡兰萍，等.靛玉红对慢性髓性白血病K562细胞增殖的抑制作用[J].中医药导报，2009，15(2):10-12.

[2]吴琦玮，葛忠良，高 月，等.靛玉红对肿瘤细胞抑制作用的研究及相关机制探讨[J].天津中医药，2008，25(1):55-58.

[3]吴正红，周 静，平其能，等.靛玉红磷脂复合物的跨膜转运及其犬体内药代动力学[J].中国药科大学学报，2007，38(4):327-331.

[4]李长玲，籍秀娟.靛玉红及其乙基和十八烷基衍生物在动物体内命运的比较[J].药学学报，1983，18(5):332-338.

[5]李珂佳，蒋学华.RP-HPLC测定大鼠静脉注射靛玉红后的血药浓度[J]. 华西药学杂志，2007，22(3):333-334.