辐照含银同种异体神经移植后动物微量细胞毒试验观察

吴燕文，辛国华，曾元临，张道坤

周围神经缺损在创伤、电损伤中较常见，目前治疗周围神经缺损的最有效方法仍是自体神经移植，由于自体材料来源有限，加之取的皮神经较细小，且易造成供区功能丧失。很多研究人员尝试用异体神经移植，并进行了大量实验研究。同种异体神经移植需要解决消除免疫性、组织保存、神经再生效果和机能恢复、术后感染等问题。处理异体神经的方法有很多，如低温冷冻、冻干、冻融、血浆浸泡、辐照等方法都被实验证实能较好的降低异体神经的抗原性及保存，移植实验也证实了较好的移植效果。但以上方法只有辐照能较好的降低异体神经的抗原性同时能灭菌，阻止肝炎、艾滋病等的病原体的传播[1]，无疑在应用于人体移植方面更具优势。但经以上方法处理的异体神经都不具有抗菌性能，不能有效防止移植后的感染。Ag+是一种极强的无机金属离子杀菌剂，笔者尝试用复方银溶液浸泡后再辐照处理同种异体神经，并观察移植术后宿主的免疫排斥反应，以期为临床治疗提供一种新的良好异体神经材料。

1 材料与方法

1.1 异体神经的制备 取6只新鲜南昌大白兔（南昌大学实验动物中心提供）坐骨神经。①辐照含银同种异体神经组：坐骨神经用生理盐水冲洗干净后，在配制好的复方银（主要含0.5%氟哌酸和0.3%硝酸银）溶液中浸泡12 h后取出，待溶液滴干，用湿无菌纱布包裹装入已消毒铝薄塑料袋中封口，送X线照射（斯科达直线加速器），照射温度为0～5℃，放射辐照时间为 12 h，总剂量 20kGy，贮存于-30～-40℃冰箱中备用；②深低温冷冻处理组：坐骨神经用生理盐水冲洗干净后，浸在保护液（DMEM+10%甘油）中15 min，取出放入已消毒的玻璃瓶中密闭封存，置于-80℃深低温冰箱中保存，10 d后可以使用。使用前，放入37℃恒温水浴中复温2 min，然后置于生理盐水（含100 U/ml庆大霉素）中浸泡15 min。

1.2 实验分组 将18只大白兔（南昌大学实验动物中心提供），不分性别，体重2.0～2.5 kg，随机分为A、B、C三组，每组6只，A组移植辐照含银同种异体神经，B组移植深低温冷冻异体神经，C组自体神经互植。

1.3 手术方法 3%异戊巴比妥钠腹腔（30 mg/kg）注射麻醉，大腿后部正中切口，显露梨状肌下缘至胫腓分叉处的坐骨神经段，移植2 cm长辐照含银同种异体神经1根，以7-0线无损伤缝线行神经束膜吻合；同样方法暴露对侧坐骨神经，移植2 cm长辐照含银同种异体神经1根。B组暴露左右坐骨神经，分别截取2 cm移植同长度深低温冷冻异体神经，C组暴露左右坐骨神经，截取2 cm长的坐骨神经后自体互植。

1.4 微量淋巴细胞毒反应试验 ①淋巴细胞悬液制备：取健康南昌大白兔肠系膜淋巴结3个，经NS和DMEM液冲洗血迹，用100目不锈钢筛研磨制成单个细胞悬液，提取2 ml，加入1/2量的淋巴细胞分离液2 000×g离心15 min，用吸管将分离液面的淋巴细胞移入试管内，再加入等量的DMEM液进行稀释1 500×g离心15 min，用毛细胞吸管吸取少量细胞液冲入记数板内，显微镜下计数，制备成5×106/ml淋巴细胞悬液，置4℃冰箱备用；②淋巴细胞毒测定：分别于术后4、8周取动脉血2 ml，注入标记好的试管内，待凝固后，1 000×g离心15 min，将上层血清移入试管内，在微量多孔反应板每空内加入50 μl抗血清、50 μl淋巴细胞悬液，轻轻振动，放入恒温培养箱内孵化（37℃，45 min），冷却后加补体（由豚鼠血清制备）100 μl，室温下培养 1 h。 取 30 μl上述液体加台盼蓝10 μl染色5 min，显微镜下计数。每个处理组均含4个平行孔。

2 结 果

微量淋巴细胞毒反应试验结果辐照含银组淋巴细胞死亡率与自体组比较无显著性差异（P＞0.05），但均低于冷冻组（P＜0.01）。 见表 1。

表1 两组淋巴细胞死亡率（±s，%）

表1 两组淋巴细胞死亡率（±s，%）

与 A、C 组比较，*P＜0.01

组别 术后4周 术后8周A 13.13±3.00 12.14±2.10 B 40.13±3.21* 31.21±3.23*C 11.34±3.11 10.02±2.79

3 讨 论

Fawett等[2]认为，神经移植体需具有以下特征：①再生轴突必须能顺利长入,并通过该移植体达到远端；②通过移植体的轴突必须成熟到具有正常的直径,正常的髓鞘化和正常的传导动作电位；③无抗原性；④能较快地获得血供；⑤移植体内再生轴突必须排列有序,以确保准确地到达靶组织、靶器官。辐照方法是通过60Coγ射线照射使雪旺（Schwann）细胞受损并降解而被吞噬细胞所吞噬或排除而降低抗原性，其残剩基膜被保留在原位，这种基膜可在神经移植中作为一种“导管”而助于周围神经的再生[3]。用辐照处理异体神经移植后，纤维组织增生和炎性细胞浸润较少，再生的神经纤维数量增多，比自体神经移植修复效果差，但优于未经处理的异体神经移植[4]。

Ag+是一种极强的无机金属离子杀菌剂，水中银离子浓度为0.01 mg/L时即有杀菌作用；其杀菌原理是带阳电荷的Ag+能够吸附住在带有阴电荷的细菌表面，甚至向细胞内渗透，与细菌蛋白结合使细菌蛋白沉淀，还可使细菌赖之起呼吸作用的酶催化变性，以及与细菌巯基酶等生物活性基团结合，使细菌机体结构破坏，导致其迅速死亡等；Ag+已作为一种有效杀菌剂广泛应用于创面覆盖物，应用于杀菌，及制作无机抗菌材料等；Ag+与铜、锌、氟等离子合用具有协同作用，杀菌作用强，并可保持较长时间杀菌；Ag+是机体内组织成分之一，过量对人体只可产生银斑，无不良反应[5]。本实验将兔同种异体神经经复方硝酸银浸泡后再经辐照，实验发现其富含抗菌物质（Ag+），抑菌试验证实其对标准菌株和临床菌株均具有很强的抗菌作用。

辐照含银同种异体神经移植后淋巴细胞毒试验显示淋巴细胞死亡率与自体移植组无明显差别，与新鲜异体组差别明显，说明对辐照含银同种异体神经移植无明显排斥反应。笔者借鉴李国辉等[6]的方法将异体神经经复方硝酸银溶液浸泡、60Coγ射线照射处理制成辐照含银同种异体神经，方法简单，既降低了抗原性，又具有较强的抗菌作用，符合神经移植材料的要求，是周围神经缺损移植的比较理想材料。

[1]Moore TM,Gendler E.Viruses absorbed on musculoskeletal allografts are inactivated by terminal ethylene oxide disinfection.J Orthop Res,2004,22(6):1358.

[2]Fawcett JW,Keynes RJ.Muscle basal lamina:a new graft material for peripheral nerve repair.J Neurosurg,1986,65(3):354.

[3]Wang XY,Fan QY.Reginergation of nerve-ending and motor end-plate of exsomatized nerve graft following irradiation.J Forth Mil Med Uinv,2000,21(4):514.

[4]李建兵,姚建民,宋建良,等.放射辐照对异体神经移植影响的实验研究.浙江临床医学,2000,2(4):222.

[5]薛广波.实用消毒学.北京:人民军医出版社,1986.704.

[6]李国辉,曹 勇,吴焱卿,等.辐照氟银猪皮的实验研究.中华整形烧伤外科杂志,1994,10(3):206.