苦参碱对上皮性卵巢癌细胞株顺铂敏感性的影响及其机制研究

张继荣

湖南省肿瘤医院（410013）

恶性肿瘤作为一种威胁人类生命健康以及降低生活质量的重大疾病，发病率呈现明显上升的趋势。卵巢恶性肿瘤的发病率居女性生殖器官恶性肿瘤的第3位[1,2]。由于病变部位的组织结构复杂性以及早期诊断手段的不足，卵巢癌的诊治一直都是妇科领域的重要研究课题。尽管肿瘤细胞减灭术以及联合铂类药物为基础化疗的综合治疗一定程度上能够缓解病痛，降低该类肿瘤患者的病死率。但是卵巢癌的复发率以及病死率仍然较高。其中，因为肿瘤细胞耐药导致的化疗失败是一个及其重要的原因，也是目前卵巢癌治疗面临的难题之一。相关学者也在不断的寻找增加卵巢癌患者对于化疗药物的敏感性的方法[3-5]。苦参碱是从中药苦参的干燥根中提取的活性物质，近年来的研究结果表明苦参碱在抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化、诱导凋亡、抗肿瘤细胞黏附与浸润转移等方面发挥了重要作用。近年来，调控细胞增殖与凋亡的转录调节因子NF-κB以及相应信号转导通路在各种抗肿瘤的辅助治疗中的作用引起了众多学者的关注。目前的研究已经明确，NF-κB的活性增加与参与凋亡抑制蛋白家族成员的表达量呈现正相关。其中Livin以及Survivin两种最新发现的凋亡抑制因子与NF-κB活性间的关系对于理解药物降低上皮细胞癌发生率这一现象具有相当的理论探讨价值[6-8]。介于以上背景，笔者提出通过苦参碱抑制处理上皮性卵巢癌细胞，通过下调NF-κB——Livin、Survivin信号通路，达到增加肿瘤细胞对于顺铂敏感性的理论设想。本文旨在探讨苦参碱干预与上皮性卵巢癌细胞对顺铂敏感性的关系，以及观察NF-κB活性、Livin、Survivin表达量与苦参碱药物干预间的联系。为上皮性卵巢癌的治疗提供借鉴性的信息。

1 资料与方法

1.1 细胞培养条件及传代

OVCAR细胞在含10%小牛血清及RPMI-1640培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，每1～2d更换培养液1次。细胞传代方法：待细胞生长至培养基底板面积70%～80%，弃培养液，加2～5mL PBS漂洗2次，弃去。加2～3mL胰酶消化3～5min；镜下看到细胞收缩变圆，弃消化液，再加3～5mL含小牛血清培养液，用吸管按顺序轻轻吹打成细胞悬液，按照1∶2～3比例进行传代，7℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养至对数生长期用于实验。

1.2 主要试剂

噻唑蓝（MTT）（北京鼎国生物技术有限公司）；NF-κB转录因子检测试剂盒（Cayman公司）；蛋白提取试剂盒（Active Motif公司）；鼠抗人NF-κB一抗（BD公司）；鼠抗人Livin一抗（Alexis公司）；鼠抗人Survivin一抗（Cell Signaling公司）；羊抗鼠二抗（Sigmal公司）。

1.3 MTT法测定细胞对药物的敏感性

取对数生长期细胞，经胰酶消化后配置成单细胞悬液。实验设药物处理组（加入顺铂药物）、细胞对照组（不加药物，只加细胞悬液）及空白对照组（加入培养液）。细胞培养24h后，分别加入0、10、20、25、30、35、40、50和60μmol/L的药物，继续培养24h。实验终止前4h，加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续培养4h，除去每孔中培养液，加入DMSO 150 μL/孔，振荡数分钟使形成晶体完全溶解，酶联免疫检测仪测定492nm处吸光度值A492，并计算该浓度下抑制率，并使用直线回归法计算药物的半数抑制浓度（IC50）。实验重复3次。存活率＝试验组A492/对照组A492×100%，抑制率＝1－存活率。

1.4 ELISA法测定NF-κB核DNA结合转录活性

应用Cayman公司转录因子检测试剂盒测定NF-κB核DNA结合活性。细胞培养孔中加入结合缓冲液90μL以及等量的核蛋白提取液。4℃过夜后用ELISA专用洗液每孔200μL冲洗。加入100μL稀释后NF-κB一抗，室温孵育1h，冲洗5次。加入100μL二抗室温孵育1h，冲洗5次。每孔加入100μL发光液，室温避光孵育40min，加入100μL终止液，450nm处读数。在阳性对照正常显色的前提下，计算各组样本吸光度的平均值，绘制标准曲线，对各组OD值进行比较。

1.5 Western blot法检测Livin、Survivin蛋白表达

总蛋白提取严格按照提取试剂盒说明书操作进行。蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，采用湿转膜法。采用5%脱脂牛奶封闭后，使用TBST洗膜，分别加入各种一抗，4℃过夜后，加入二抗室温反应1h。洗脱后显影。根据预期相对分子质量大小区域出现的特异性条带判断蛋白表达量的高低。应用Bio-Rad公司Quantity-one软件分析。

1.6 统计分析

采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义差异。

2 结 果

2.1 苦参碱增加顺铂对上皮性卵巢癌细胞的增殖的抑制作用

上皮性卵巢癌细胞在苦参碱作用后，对顺铂的敏感性均有增加，表现为药物对细胞的增殖抑制效应增加，并且这种抑制效应随浓度的增大而增大。其中，顺铂对10、40、160μmol/L苦参碱处理的3组细胞的IC50分别为（29.75±5.27）、（25.61±4.27）和（17.29±3.35）μmol/L，顺铂对对照组细胞的IC50为（31.65±2.23）μmol/L。具体结果见图1。

图1 不同浓度顺铂对各组细胞的抑制强度

2.2 苦参碱处理后各组细胞中NF-κB核转录活性的变化

图2 Livin在上皮性卵巢癌细胞中表达的灰度分析

NF-κB核DNA结合活性检测结果显示，苦参碱处理各组细胞核内NF-κB蛋白表达较对照组呈现显著降低，其中苦参碱（10、40、160μmol/L）处理的3组细胞的NF-κB蛋白表达分别为（0.507±0.027）、（0.375±0.019）和（0.311±0.017），对照组NF-κB蛋白表达为（0.705±0.032）。表明苦参碱处理可以使NF-κB从胞质进入细胞核内的转录活性降低。

2.3 苦参碱处理后各组细胞中Livin、Survivin蛋白表达的变化

Western blot检测结果显示，苦参碱作用于卵巢癌细胞后Livin、Survivin的表达呈浓度依赖性下调趋势，与对照组比较，差异有统计学意义。具体结果见图2。

3 讨 论

卵巢恶性肿瘤的病死率居目前妇科生殖道恶性肿瘤病死率的首位，其原因除对其发生、发展过程尚缺乏了解外以及难以早期诊断外，治疗过程中及易产生的药物敏感性降低、肿瘤细胞对药物耐受现象也是目前临床一个棘手的问题。上皮性癌是最为常见的原发性卵巢癌，主要治疗手段是肿瘤细胞减灭术辅以铂类为主的化疗。铂类药物作为卵巢上皮细胞肿瘤的一线化疗药物已经应用40余年，耐药问题也日益突出，致使患者尤其是晚期肿瘤患者的生存率以及生活质量受到严重的影响。怎样有效的提高肿瘤细胞对药物的敏感性成为众多学者关注的问题。最近的研究发现，化疗后NF-κB的活化，可以上调凋亡抑制蛋白，增前凋亡抵抗，从而导致肿瘤细胞对于化疗药物的拮抗作用。这一信号转导通路的改变可能是肿瘤细胞化疗后药物敏感性下降的途径之一。苦参碱作为苦参中的重要活性物质，研究发现该成分可以阻止人白血病细胞的增殖周期，该药物在诱导细胞凋亡的同时可以导致一些重要的细胞因子发生基因、蛋白水平的改变。该药物的使用是否可以增加肿瘤细胞对药物的敏感性以及其中潜在的机制是笔者本次研究探索的目标。

本次研究首先观察苦参碱处理的细胞是否对顺铂的敏感性有增加的现象发生。结果显示，顺铂对10、40、160μmol/L苦参碱处理的3组细胞的IC50分别为（29.75±5.27）、（25.61±4.27）和（17.29±3.35）μmol/L，顺铂对对照组细胞的IC50为（31.65±2.23）μmol/L。提示苦参碱能够有效的增加肿瘤细胞对顺铂药物的敏感性。并且这种增敏现象有着剂量依赖性。在此基础上，我们发现NF-κB核DNA结合活性检测结果显示，苦参碱处理各组细胞核内NF-κB蛋白表达较对照组呈现显著降低。该结果提示，苦参碱的作用可能是与NF-κB介导的凋亡抑制现象有关。

同时，本次研究重点关注NF-κB介导凋亡抑制信号通路中两个重要的蛋白Livin、Survivin的表达情况。结果显示上述两种凋亡抑制蛋白的表达量在苦参碱处理后均呈现明显的下调现象。因此，笔者认为苦参碱增加上皮性卵巢癌细胞的敏感性现象可那与其抑制NF-κB活性，阻断凋亡抑制蛋白Livin、Survivin蛋白的表达，诱导细胞的凋亡现象有关。

本此研究将NF-κB及其信号通路为观察对象。NF-κB作为一种与肿瘤细胞凋亡关系密切的功能蛋白，研究其介导的信号转导通路与顺铂药物敏感性的关系，对于我们扩展肿瘤治疗的思路，预测细胞对药物的敏感性有着积极的借鉴意义。

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