自制吸附萃取搅拌棒结合气相色谱嗅觉计、气质联用仪分析肉味香精呈香组分

邓 莉， 邢海鹏， 郝学财， 刘 娜， 郭 聪

(天津春发食品配料有限公司 研发中心， 天津 300300)

肉味香精在肉制品加工中起着至关重要的作用，它可以丰富和增强产品的特征香气，提高产品的吸引力，协调产品的香气使口感更加圆润、丰满，掩蔽或修饰产品本身固有的风味并且可以降低产品成本[1]. 因此，肉制品行业的发展与肉味香精的研发息息相关，而肉味香精呈香组分的分析将为香精的研发提供重要依据.

搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction, SBSE)是在固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)基础上发展起来的一种新型样品前处理技术. 该技术与SPME一样具有简单、高效、快速，重现性好，绿色无溶剂等优点，并在萃取过程中吸附搅拌棒自身完成搅拌，避免了在Fiber SPME中搅拌子的竞争吸附，而且其萃取固定相的体积可达到SPME的50倍以上，因此，富集倍数明显提高[2-4]. 目前，国内尚无此类商品生产，国外价格昂贵. 因此，对SBSE技术的研究是一项十分具有创新性和实际意义的工作.

热脱附作为一种快速样品预处理技术，近年来一直受到分析工作者的关注，在各行业的应用报道逐年增加，但对咸味香精的风味研究尚未见报道[5].

在仪器检测中，气质联用(GC/MS)无疑是香气分析的首选，由于GC具备对低沸点组分良好的分离性能，结合MS对于未知化合物强大的定性能力，使得GC/MS在香气分析中一直发挥着重要作用. 但香气物质中特征化合物大多数阈值很低，在进行香气研究时，即使利用目前最灵敏的检测器，其灵敏度未必能超过鼻子，鉴定出所有化合物[6-8]. 此外，GC/MS无法用来确定各种香气化合物对总体香气贡献的大小. 气相色谱嗅觉计联用(GC/O)技术是解决这些问题的一种理想方法，GC/O技术是指气相色谱与嗅觉计相结合，香气组分首先通过GC进行分离，再从嗅觉计出口逐一流出，由嗅辩人员嗅闻加以判断，确定物质种类[9]. GC/O属于一种感官检测技术，即气味检测法，其中人的鼻子起到了检测器的作用. GC/O技术是用来研究香气的有力工具，对鉴别特征香气化合物、香气活性化合物及用来确定各组分的香气强度及贡献很有价值. GC/O技术作为一种新型的香气分析方法，在国外应用较多，但国内的相关研究并不多见，特别是利用GC/O、GC/MS两种方法结合进行对比分析的尚未见报道.

图2 溶胶-凝胶法制备SBSE涂层Fig.2 Preparation of SBSE coating by sol-gel method

1 实验部分

1.1 实验材料

肉味香精，来源于市场上认可率较高的香精产品；羟基封端二甲基聚硅氧烷(OH-PDMS),分析纯，山东莱州鑫泰化工有限公司；甲基三甲氧基硅烷(MTMS)，分析纯，湖北武大有机硅新材料有限公司；含氢硅油(PMHS)，分析纯，武汉化工厂；三氟乙酸(TFA)，分析纯，天津化工厂；二氯甲烷，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司.

1.2 实验仪器

5975-6890N型气相色谱-质谱联用仪，Agilent公司；sniffer 9000系列嗅觉计，瑞士BRECHBUHLER公司；UNITY热脱附仪，美国MARKES公司 ；HP-5 ms石英毛细管色谱柱( 30 m×0.25 mm，0.25 μm)，Agilent公司.

1.3 实验方法

1.3.1吸附萃取搅拌棒的制备

1) 棒体的制作 选取长25 mm，直径为3 mm的玻璃管，利用酒精喷灯将比棒体略短的铁芯封于管内，搅拌棒结构如图1.

图1 吸附萃取搅拌棒Fig.1 Sorptive extraction stir bar

2) 棒体表面的预处理 依次用CH2Cl2，1 mol/L NaOH溶液，0.1 mol/L HCl溶液对棒体表面进行处理，最后用去离子水冲洗至中性，在150 ℃氮气流下烘干.

3) 棒体涂层的制作 取400 mg OH-PDMS加CH2Cl2稀释，依次加入100 mg PMHS、100 μL MTMS、80 μL TFA充分搅拌, 放入超声清洗仪中超声30 min以辅助反应进行. 加热除去部分溶剂，待溶液成为具有一定黏度的溶胶时，将步骤2)中处理过的搅拌萃取棒，置于溶胶中30 min取出，完全干燥后，玻管外表面上形成溶胶-凝胶涂层，如此反复多次，直至涂层达到所需的厚度为止，室温下成胶12 h. 其反应过程如图2.

4) 棒体涂层的老化及杂质去除 在氮气保护下，进行程序升温老化150 ℃保持4 h，180 ℃保持4 h，然后220 ℃保持60 min，即完成老化. 最后将制作好的搅拌萃取棒在80 ℃蒸馏水中恒温浸泡2 h, 50 ℃二氯甲烷回流2 h，氮气吹干,以除去涂层中未参加反应的物质.

1.3.2搅拌棒吸附采样

取肉味香精10 g，加入适量去离子水搅匀，置于50 mL顶空瓶中，放入吸附萃取搅拌棒，搅拌速度500 r/min，萃取，并对萃取温度及时间进行单因素考察.

1.3.3热脱附仪进样

将搅拌棒装入热脱附仪，预吹12 min，初级脱附，脱附时间5 min，冷阱捕集温度为-8 ℃，脱附温度160 ℃，脱附时间2 min. 传输线温度120 ℃，加热阀温度120 ℃，同时，对初级脱附温度进行单因素考察.

气质联用仪参数设置：进样口温度为230 ℃，不分流，柱流速1.0 mL/min，电离电压70 eV，质量扫描范围40～400 u，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，辅助温度230 ℃，检索谱库NIST05、自建谱库，程序升温梯度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min.

1.3.4分析检测

本实验仪器采用在色谱柱出口安装“石英三通”进行1∶1分流，并通过多次实验调整两根出口毛细管长度，以保证样品被同时引入MS和Olfactory(见图3)，令两种检测的出峰时间尽量保持一致，利于两种结果的观察比对.

图3 GC/MS—olfactory装置Fig.3 Figure of GC/MS—olfactory instrument

2 实验结果与讨论

2.1 主要影响因素及最佳前处理参数的确定

2.1.1不同搅拌萃取温度对萃取效果的影响

在萃取温度的优化实验中选择20，30，40，50，60 ℃五个梯度进行实验，萃取60 min，每个梯度重复2次取平均值. 各萃取温度下得到的呈香组分总峰面积如图4. 结果表明，低于50 ℃时温度对萃取量的影响不大，提高温度并没有令萃取量显著增加，超过50 ℃后，萃取量反而减少，主要由于随温度的提高呈香组分在水相中的分配比例降低，部分挥发到气相当中. 根据萃取非平衡理论，固定萃取时间和搅拌速度不变，固定相涂层上待测物的吸附量正比于其在液相中的浓度，因此，选择室温作为最佳实验条件.

图4 萃取温度对萃取效果的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.1.2不同搅拌棒萃取时间对萃取效果的影响

本实验选择15，30，60，90 min四个时间梯度，室温萃取，每个梯度重复2次取平均值，各萃取时间下得到的呈香组分总峰面积如图5. 结果显示，起初萃取量随时间的延长而增加，60 min后再增加萃取时间，萃取量并无明显提高. 可见60 min时已达到萃取平衡，能够将香气成分充分萃取，因此，选择60 min作为最佳实验条件.

图5 萃取时间对萃取效果的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.3热脱附仪不同初级脱附温度对前处理效果的影响

将吸附管装入热脱附仪，预吹2 min，初级脱附温度分别选择120，150，180 ℃，脱附时间5 min，比较不同初级脱附温度对提取物总量的影响，如图6.

结果表明，脱附温度为150 ℃时可将吸附管中的吸附组分充分脱附. 此外，过高的温度还可能引起组分间的化学反应，令结果失真. 同时，由于各种吸附剂热稳定性的限制，所选热脱附温度必须低于其极限使用温度.

图6 初级脱附温度对提取物总量的影响Fig.6 Effect of desorption temperature on extraction efficiency

2.2 分析结果

肉味香精分析的质谱总离子流图如图7，MS结果通过对NIST05库和自建库进行谱库检索得到，GC/O结果由训练有素的调香人员嗅闻辨别得到，对于质谱库中不存在物质通过质谱解析加以确认，结果见表1.

图7 肉味香精呈香组分的GC/MS总离子流图Fig.7 Total ion chromatogram of meat flavor aroma components

2.3 质谱库中不存在物质的质谱解析鉴定

调香人员通过GC/O嗅辩检出的巯基丁醇、巯基丁酮等物质由于NIST05库中不存在质谱数据，不能进行谱库检索，可以利用质谱解析[10]理论进行定性. 例如，图7中6号峰质谱图如图8，谱图中质量数最高的峰为m/z106，与碎片峰m/z91相差15u，与碎片峰m/z88相差18u，为合理中性丢失，据此判断m/z106为分子离子峰(偶数)，且主要碎片离子均为奇数(m/z62除外)，可判断未知物中不含元素N；根据分子离子峰的同位素M+2丰度为4.8%，可知未知物中含有1个S和1个O; 根据M+1丰度为4.8%，可知未知物中含有4～5个C,在上述C，S，O数量范围内，分子量106u合理的化学式只能为C4H10SO. 按照式(1)计算环加双键值为0，说明未知物中不含环或双键结构，同时，由碎片峰M-33(m/z73)可知未知物中含—SH, 由碎片峰M-18(m/z88)可知未知物中含—OH. 因此，推断此物质为巯基丁醇,与GC/O分析结果一致.

表1 肉味香精呈香组分GC/MS、GC/O分析结果

分子的环加双键值=(2X+2+Z-Y)/2

(1)

其中：X=C，S，Si;Y=H，F，Cl，Br，I; Z=N，P

据此方法，其他NIST05库中无质谱数据且被GC/O定性检出的物质均可加以推断及确认.

图8 总离子流图中6号峰质谱图Fig.8 Mass spectrum of No.6 peak on TIC

3 结 论

本实验通过溶胶-凝胶法制备的聚二甲基硅氧烷涂层吸附萃取搅拌棒，对吸附质有强烈的吸附能力且成本低廉，适用于香精呈香组分的提取. 配合热脱附仪使用具有简单、快速、绿色无溶剂等优点. 该方法相比于传统的SPME法具有更大的萃取固定相体积，因此，具有较高的灵敏度，特别适合对低含量组分的检出，在香精香料分析及食品分析领域的应用前景广阔.

利用GC/MS、GC/O检出组分情况如图9. 图9及表1结果显示，利用GC/MS、GC/O两种方法共检出物质31种，其中，质谱检出组分26种，闻香器检出组分24 种. 两种方法均能检出的19种物质可以确定为此种肉味香精的基本组成，例如其中的3-甲硫基丙醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、乙基麦芽酚、4-甲基-5-噻唑乙醇等. 仅GC/MS检出而GC/O未检出的物质共7种，为香精中含量相对较低的物质，对呈香贡献不大. 可能由各组分间的反应、非香精类食品添加剂的加入、包装材料的污染或天然香料的带入等原因造成，如其中的3-甲硫基丙醛可能由3-甲硫基丙醇氧化而来，BHT为抗氧化剂，邻苯二甲酸乙脂为塑料容器制造过程中添加的增塑剂，而姜黄烯、没药烯等可能由天然辛香料带入. 仅GC/O检出而GC/MS未检出的物质共5种，可判断为香精中低含量、低域值的呈香组分或含量高但NIST质谱库中不存在的物质，此类物质往往对香气形成具有重要贡献，因此不可忽视，如其中的巯基丁醇、巯基丁酮、2，5-二甲基-3-呋喃硫醇等是肉味香精的关键性香料. 可见，GC/O的分析结果是对GC/MS结果的重要补充.

图9 GC/O、GC/MS检出组分数量Fig.9 Number of detectedcompounds by GC/O and GC/MS

由于GC/O和GC/MS两种检测方法对于化合物的鉴别分别依赖于人的感官判断和仪器的谱库检索，两者的准确性均在一定程度上存在不足. 本实验仪器采用在色谱柱出口安装“石英三通”进行1：1分流，样品被同时引入MS和Olfactory，通过对两种分析方法的结合，消除了两者的检测盲点，实现优势互补；同时，对于NIST05库中无质谱数据且被GC/O定性检出的物质，利用质谱解析理论加以确认，令检测结果更加真实、准确，为高级香精的调配及仿香工作提供有价值的参考数据.