慢性饮酒对大鼠左心室心肌胶原含量及舒张功能的影响

林美光 王佩显 崔让庄 曹 丽 王伟强 张 丽 陈 倩 赵福梅

长期过量饮酒会导致左心室功能障碍，并且最终可能会引发充血性心力衰竭。有文献报道高达36%的扩张型心肌病患者是由过量饮酒引起的[1]。酒精性心肌病的表现主要有心脏肥大、心肌纤维化、心肌纤维结构损害，早期舒张功能损害至晚期收缩功能下降，并且高血压和中风的风险也增加。目前酒精性心肌病的发病机制还不十分清楚[2]。在本研究中，乙醇喂养大鼠16周后检测心脏功能，尤其是左心室舒张功能，同时测量左心室心肌胶原含量的变化，探讨两者的相关关系，以期揭示乙醇所致心脏功能损害的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料24只8周龄雄性Wistar大鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，无特定病原体（SPF级），平均体质量为（269.83±9.08）g，随机分为对照组（12只）和乙醇组（12只）。乙醇（46%V/V）购自天津市直沽酿酒厂。羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所第一分所。试剂Trizol购自上海生工生物工程技术服务有限公司。逆转录-聚合酶链反应（RT－PCR）试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 慢性乙醇喂养大鼠 所用实验大鼠均给予标准饲料（中国医学科学院动物研究所，北京）喂养。对照组和乙醇组分别给予水和乙醇溶液作为饮料，喂养16周。每天记录实验组大鼠摄入乙醇的量。最后计算大鼠平均每天每千克体质量摄入乙醇的量。实验末期对2组大鼠进行超声心动图检查，最后处死大鼠并取出心脏，应用羟脯氨酸测试试剂盒测定心肌羟脯氨酸含量，RT-PCR检测心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达。

1.2.2 经胸超声心动图（TTE）检查 仪器为美国Acuson公司Sequoia512型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率为8 MHz，配备组织多普勒成像（tissue Doppler imaging,TDI）和心脏功能测定软件包及同步Ⅱ导心电图。大鼠以0.4%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射，麻醉满意后，固定、去毛，行TTE检查。于心尖四腔面行多普勒频谱检测，获取二尖瓣E峰峰速度（E）、左室等容舒张时间（IVRT）。随后启动TDI速度模式，取心尖四腔面，脉冲多普勒取样容积置于二尖瓣内环，描记其运动频谱，测量E峰峰速度（Ea）、A峰峰速度（Aa）及Ea/Aa比值。测量采取3～5个心动周期测量的数据，取其平均值。由于鼠科动物心率快，M型曲线及多普勒血流频谱扫描速度设置>100 mm/s。所有图像数据存盘，以便分析。超声测量参照美国超声心动图学会制定的标准[3]。

1.2.3 心肌羟脯氨酸含量的测定 依照羟脯氨酸试剂盒说明书进行。

1.2.4 RT-PCRTRIZOL法提取心肌细胞总RNA，以MMLV逆转录为cDNA，产物进行目的基因及内参基因的PCR扩增。全部引物设计均经GenBank查对无误后进行合成。Ⅰ型胶原上游引物为5′-CCCTGAAGTCAGCTGCATAC-3′，下游引物为5′-ATATTTTTCTGGGCAGAAAG-3′，扩增长度196 bp；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）上游引物为5′-AGTCCATGTCATCACTGCCAC-3′、下游引物为5′-TGGGAG TTGCTGTTGAAGTCAC-3′，扩增长度342 bp。Ⅲ型胶原上游引物为5′-CCACCCTGAACTCAAGAGTGG-3′，下游引物为5′-CCATCCTCTAGAACTGTGTAAGTG-3′，扩增长度444 bp；内参GAPDH上游引物为5′-ACAAAGTGGACATTGTTGCC-3′，下游引物为5′-AAACATGGTGAAGACGC-3′，扩增长度242 bp。Ⅰ型胶原的PCR扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环。Ⅲ型胶原的PCR扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环。产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，凝胶成像分析仪进行半定量分析，以Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因与GAPDH基因的灰度比值表示Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，行两样本均数比较的t检验，两变量间应用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

乙醇组大鼠平均摄入乙醇量（5.00±0.82）g/（kg·d）。

2.1 2组大鼠左室舒张功能参数的比较 与对照组相比，乙醇组二尖瓣E峰值降低、IVRT延长，二尖瓣内环TDI舒张早期速度Ea降低，舒张晚期速度Aa增高（P<0.05或P<0.01）。对照组的Ea/Aa比值>1，而乙醇组<1，2组Ea/Aa比值差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

表1 2组大鼠左室舒张功能参数比较 （±s）

表1 2组大鼠左室舒张功能参数比较 （±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

组别对照组乙醇组t n 12 12 E(m/s)0.83±0.06 0.71±0.12 2.869**IVRT(ms)25.08±4.72 33.50±5.68 3.948**Ea(cm/s)8.30±1.58 6.33±2.14 2.568*Aa(cm/s)6.54±2.65 12.64±6.45 3.027**Ea/Aa 1.35±0.31 0.57±0.25 6.692**

2.2 2组大鼠心肌羟脯氨酸含量和胶原的mRNA表达的比较 乙醇组的羟脯氨酸含量，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的mRNA表达水平以及Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值高于对照组（P<0.01），见表2，图1、2。

表2 2组大鼠左室心肌羟脯氨酸含量和胶原的mRNA表达比较±s）

表2 2组大鼠左室心肌羟脯氨酸含量和胶原的mRNA表达比较±s）

**P＜0．01

组别对照组乙醇组t n 12 12羟脯氨酸（mg/L）2.27±0.17 3.21±0.28 18.391**Ⅰ型胶原0.47±0.07 1.10±0.09 11.845**Ⅲ型胶原0.63±0.08 1.28±0.17 9.067**Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值0.75±0.02 0.87±0.04 9.893**

图1 RT-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA表达

图2 RT-PCR检测Ⅲ型胶原mRNA表达

2.3 相关性分析 心肌羟脯氨酸含量、心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达水平及Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值都与左室等容舒张时间（IVRT）呈正相关（P<0.05），与Ea/Aa比值呈负相关（P<0.01），见表3。

表3 左室心肌羟脯氨酸含量及Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达水平与左室舒张功能参数的相关性

3 讨论

在美国，酒精中毒是当今五大公众健康问题之一，它经常会引起心肌功能障碍。在中国，过量饮酒也是个普遍社会现象。长期酗酒可以导致酒精性心肌病（alcoholic cardiomyopathy，ACM），常表现为充血性心力衰竭[4]。

在本研究中，大鼠慢性饮酒，摄入的乙醇量是（5.00±0.82）g/（kg·d），该摄入量与人类酒精性心肌病患者的乙醇摄入量[大约3～4 g/（kg·d）]相当[4]。饮酒时间16周，约为大鼠寿命的1/9，这与人类ACM患者饮酒史8年左右相接近。采用多普勒超声心动图-二尖瓣血流频谱，理论上可以检测大鼠E、A、E/A比值和IVRT。然而，由于大鼠心率过快（＞200次/min），因而E、A峰融合，难于分析E、A比值，因此本实验在评价大鼠的舒张功能时，采用了TDI技术。反向的Ea、Aa峰分别代表心室舒张早期及心房收缩期左室心肌扩张性运动，Ea/Aa比值被认为是评价心室舒张功能的良好指标，它不依赖于左室负荷的大小。本研究发现，提示乙醇喂养大鼠16周后可出现左室舒张功能异常。

临床上早已发现酒精性心肌病会出现心肌纤维化，但其病理机制尚未完全明确[5]。最近有研究报道乙醇引发人心力衰竭的发病机制可能与心肌细胞骨架、细胞外基质和（或）心肌结构蛋白的改变有关[1]。本研究结果提示长期饮酒可以增加大鼠心肌胶原的合成。胶原过度沉积会造成心肌纤维化，这是导致长期过量饮酒者左室心肌重构和心衰的重要原因[5]。Cheng等[6]也发现慢性饮酒会直接造成心肌收缩力减弱，并且会引发进行性左室舒张功能损害和左室心肌重构。

本研究分析发现心肌羟脯氨酸含量、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达和Ⅰ型/Ⅲ型胶原mRNA比值都与IVRT呈正相关，而与Ea/Aa比值呈负相关。这些结果提示心肌胶原蛋白水平和mRNA水平含量的变化都与心脏舒张功能的改变明确相关。由于胶原僵硬度较高，纤维化会降低心室顺应性，其结果会造成心室早期充盈降低和心房代偿性收缩[7]，在本研究中体现为Ea/Aa<1及IVRT延长。

总之，乙醇喂养大鼠16周后导致心脏损害，表现为心脏舒张功能减低和心肌胶原合成增加，这提示心肌胶原合成增加可能是大鼠心脏舒张功能减低的一个重要发病机制。本研究乙醇组大鼠未出现收缩性心衰，即尚未构成晚期ACM模型，可能因饮酒时间尚短；本研究也仅揭示出饮酒导致心肌胶原紊乱的现象，其具体机制有待进一步研究。

[1]Haddad GE,Saunders L,Carles M,et al.Fingerprint profile of alcohol-associated heart failure in human hearts[J].Alcohol Clin Exp Res,2008,32(5):814-821.

[2]Ren J,Wold LE.Mechanisms of alcoholic heart disease[J].Ther Adv Cardiovasc Dis,2008,2(6):497-506.

[3]Slama M,Maizel J.Echocardiographic measurement of ventricular function[J].Curr Opin Crit Care,2006,12(3):241-248.

[4]Lui CY,Guan ZJ,Eskelson CD.Cardiac function in rats exposed to chronic alcohol and nutritional deficiency involving selenium and vitamin E[J].J Appl Res,2004,4(3):427-438.

[5]Wang LP,Zhou ZX,Saari JT,et al.Alcohol-induced myocardial fibrosis in metallothionein-null mice[J].Am J Pathol,2005,167(2):337-344.

[6]Cheng CP,Cheng HJ,Cunningham C,et al.Angiotensin II type 1 receptor blockade prevents alcoholic cardiomyopathy[J].Circulation,2006,114(3):226-236.

[7]Martos R,Baugh J,Ledwidge M,et al.Diastolic heart failure;evidence of increased myocardial collagen turnover linked to diastolic dysfunction[J].Circulation,2007,115(7):888-895.