回神颗粒对急性脑梗死大鼠长时程增强的影响

庞 莹，韩大东，杨 卓，陈宝贵

300071 南开大学医学院（韩大东，杨 卓）

301700 天津市武清区中医医院（陈宝贵）

脑卒中是严重危害人类健康和生命安全的常见的难治性疾病，中医学将其列为“风、痨、臌、膈”4大疑难病之首，存在着明显三高（发病率高、致残率高、病死率高）现象。脑卒中又以缺血性中风为多，急性脑缺血后常有相应的运动、感觉、知觉以及学习记忆障碍，其中学习记忆障碍最为常见持久。回神颗粒是导师陈宝贵教授在长期临床实践中，在不断总结用药经验基础上研制而成，是治疗脑缺血的有效中药复方制剂，具有良好的脑神经细胞保护作用。在前期行为学实验中，已经证明回神颗粒可以提高大鼠智力，增强学习记忆能力[1]，本次研究拟进一步证实其提高大鼠学习记忆能力的作用机制。

1973年，Bliss和他的同事在兔海马中发现一种高频刺激诱发的长达数小时的突触传递增强，即长时程增强（LTP）[2]，LTP被认为是神经突触传递和可塑性的一种表现形式[3]。在中枢神经系统中，海马是与学习记忆、情绪和行为功能密切相关的重要脑区，其突触可塑性和传递增强则与学习记忆功能密切相关，大量的研究证实LTP与记忆形成的分子机制有高度的一致性，LTP已被广泛地认为是研究记忆的最佳细胞模型[3]。本研究就从观察大鼠海马LTP的变化来阐述回神颗粒改善学习记忆能力的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 PowerLab，澳大利亚ADInstruments公司；头部立体定位仪，日本Narishige；回神颗粒，天津武清中医医院生产。

1.2 分组、建模与给药 48只健康雄性Wistar大鼠，体质量250～320g，由军事医学科学院提供。随机分为模型组、对照组、药物组，各组再分成1 d、3 d、7 d 3个亚组，每个亚组8只。

缺血模型大鼠参照Zea-Longa线拴法复制大脑中动脉缺血模型（MCAO）。大鼠用10%水合氯醛（0.9 mL/250g）腹腔注射麻醉，暴露出左侧颈总动脉和分叉部，分离动脉分叉处的颈内动脉和颈外动脉，将颈外动脉近心端结扎，将预先准备好的直径为0.235 mm、长约5 cm、前端加热成圆形的渔线，用肝素浸泡后插入颈内动脉，直至有阻力时，即阻断大脑中动脉（MCA）入口处，清洁缝合伤口。

待大鼠清醒后按Zausinger六分法对其神经功能进行评分。0分，不能自发行走；1分，自由走动状态下向病变对侧旋转；2分，抓住鼠尾，大鼠向病变对侧旋转；3分，对于施向病变对侧的侧压力抵抗力下降者；4分，不能伸直病变对侧前爪，甚至全身向对侧屈曲；5分，无神经功能缺损。剔除5分者。

药物组大鼠待建模结束、清醒、评分后，灌胃给药，从建模第一天起连续每日给药至测LTP，0.7g/（kg·d）。

1.3 电生理学 实验大鼠予30%乌拉坦（1.2g/kg）麻醉，固定于头部立体定位仪，检测海马内嗅区前穿通纤维（PP）和海马齿状回（DG）之间长时程增强（LTP）。依据Paxinos和Watson大鼠脑立体定位图谱（1986年），记录LTP时，置于PP的刺激电极为前囟后7.8～8 mm，中线旁4～4.5 mm；置于DG的记录电极位于前囟后3～3.8 mm，中线旁1.5～2.5 mm。用比较接近生理变化的theta频率刺激（TBS）诱导出LTP。记录电极和刺激电极均缓慢插入，直到选一固定强度并能记录出最大群体峰电位（PS）的部位。检测刺激为单个方波，波宽0.1 ms，选取能诱发最大PS幅度1/2～1/3的强度。记录20 min低频（0.1 Hz，波宽0.1 ms）诱导的反应作为基础值，再给予高频刺激（6个5 Hz的串刺激，每个串刺激有5个频率为100 Hz的单脉冲，TBS重复10次，每次间隔20 s）诱导LTP。记录并保存刺激前20 min至刺激后2 h的反应，分析兴奋性突触后电位（EPSP）的斜率和PS的幅值。

1.4 数据分析 排除没有引出波形大鼠和过高或过低数值，每组有5只大鼠进入数据分析。实验结果以平均数±标准差（±s）表示，组间差异采用方差分析。

2 结果

2.1 神经功能评分 大鼠建模清醒后进行第一次评分，之后随机入组，经统计各组大鼠评分差异无统计学意义，具有可比性见表1。之后每天给药前予以评分，各组大鼠在测LTP之前进行最后一次评分，模型组评分均有所下降，药物3 d组和药物7 d组评分增高，经统计药物7 d组与模型7 d组的差异有统计学意义，见表2。

表1 各组大鼠建模后第一次神经功能评分比较（±s）

表1 各组大鼠建模后第一次神经功能评分比较（±s）

组别模型组药物组n55 1 d 1.875±0.8345 1.500±0.5477 3 d 2.000 0±0.500 0 1.833 3±0.752 8 7 d 1.833 3±0.408 2 2.000 0±0.707 1

表2 各组大鼠LTP前最后一次神经功能评分比较（±s）

表2 各组大鼠LTP前最后一次神经功能评分比较（±s）

注：①与模型7d组比较，P<0.05。

组别模型组药物组n55 1 d 1.750 0±0.707 1 1.666 7±0.516 4 3 d 1.888 9±0.333 3 2.333 3±0.816 5 7 d 1.666 7±0.516 4 2.400 0±0.547 7①

2.2 LTP

2.2.1 兴奋性突触后电位（EPSP）的斜率 各组大鼠均能诱导出LTP，各个亚组中对照组与模型组的EPSP斜率的差异都有统计学意义（1 d组P<0.05，3 d组与7 d组P<0.01）。1 d组中，药物组的EPSP斜率高于模型组，但差异无统计学意义，见图1。随着治疗时间的延长，药物组EPSP斜率呈现增高趋势，7 d时明显高于1 d；而模型组基本无变化；两组相比差异有统计学意义（3 d组P<0.05，7 d组P<0.01；见图 2、图 3）。

图1 1d组高频刺激（HFS）后EPSP斜率的比较

图2 3d组高频刺激（HFS）后EPSP斜率的比较

图3 7d组高频刺激（HFS）后EPSP斜率的比较

2.2.2 PS幅值 模型组与对照组的PS幅值相比差异有统计学意义（1 d、3 d、7 d组均为 P<0.01）。随着天数的增加，模型组与药物组的PS幅值均有所增高，但药物组增幅高于模型组（1 d组P<0.05，3 d组与7 d组P<0.01）。（如图4、图5、图 6所示）

3 讨论

图4 1d组高频刺激（HFS）后PS幅值的比较

图5 3d组高频刺激（HFS）后PS幅值的比较

图6 7d组高频刺激（HFS）后PS幅值的比较

急性脑卒中时神经系统的一些连接被破坏，其恢复是一个重新建立信号连接的过程。为调节各种适应性反应，神经系统的回路在整个生活过程中都是可变、修饰或称为可塑的，它可影响神经系统的生长发育、神经的损伤和修复及学习记忆多种脑功能，而突触连接变化是学习记忆的神经基础[4]。脑的可塑性包括所有神经功能重组的可能机制：复原功能上相同而未损通路，突触发生，树突发芽，强化现有的但功能沉默的突触连接，促进梗死区周围LTP，生存的神经细胞的纤维发芽等。LTP现象被认为反映了突触水平的记忆过程,一些损害学习记忆的因素可减低或阻断LTP的形成,而易化LTP的因素或药物能提高动物的学习记忆能力[5]。LTP的形成机制十分复杂，其中心环节是细胞内Ca2+浓度升高以及由此引发的下游生化事件，如蛋白激酶活化、N-甲基-D天门冬氨酸受体 (兴奋性神经递质受体)表达增多等[6]。Sopala等[7]研究表明短暂的大脑中动脉闭塞导致病灶同侧的海马脑片诱导LTP的僵直刺激只产生短暂的增强，在1h内恢复到僵直前水平，表明短暂的大脑中动脉闭塞导致病灶同侧的海马功能障碍。

回神颗粒由人参、石菖蒲、鹿角、灵芝、丹参、五味子、川芎等药物组成，在治疗创伤性脑损伤、脑梗死[8]、脑出血[9]、各种痴呆等[10]神经疾病方面都取得了良好的疗效。本文记录了通过灌服回神颗粒治疗的急性脑梗死大鼠内嗅区前穿通纤维-海马齿状回（PP-DG）的LTP，PS幅值和EPSP斜率增大都反映了突触后细胞同步活动的增强，这些电生理指标的改变必然会影响突触后神经元的动作电位的产生，影响学习记忆等高级神经反射活动。结合同时期的大鼠神经功能评分，结果发现大鼠PP-DG的LTP效应强度与大鼠神经功能评分的改善是平行的。

笔者的研究表明，回神颗粒能改善大鼠脑缺血后神经功能的缺损，纠正由永久性大脑中动脉闭塞引起的缺血同侧海马DG区基本的突触传递降低和单脉冲刺激海马穿通纤维引起的齿状回颗粒细胞的共同发放幅度的降低，消除缺血对缺血同侧海马DG区突触传递造成的损害，可以提高由于缺血造成的海马DG区LTP的幅度，并能提高其斜率。笔者认为，回神颗粒通过提高缺血后突触传递的效率来促进脑缺血后突触可塑性的形成，进而影响脑缺血后大脑功能的重组。

突触可塑性依赖于不同突触前、突触后神经元机制和突触周围的胶质细胞[11]，本实验研究虽然提示回神颗粒影响了LTP诱导和维持，但尚不能揭示其影响LTP的机制，这是值得进一步研究的课题。

[1]陈宝贵，赵振发，吕培红，等.回神丹颗粒剂对大鼠智能障碍行为的影响[J].中国医药学报，1998，13(2):73-74.

[2]Bliss TVP,Collingridge GL.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus[J].Nature,1993,361:749.

[3]Markevich V,Scorrsa AM,Dawe GS,et al.Cholinergic facilitation and inhibition of long-term potentiation of CA1 in the urethane-anaesthetized rats[J].Brain Res,1997,754(1-2):95.

[4]Boniface SJ,Ziemann U.Plasticity in the Human Nervous System.Investigations with Transcranial Magnetic Stimulation[J].Brain(S0006-8950),2004,127(5):1212-1213.

[5]Bliss TV P,Collingridge G L.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus[J].Nature,1993,361:31.

[6]Kullmann DM,Asztely F,WalkerMC.The role of mammalian ionotropic receptors in synaptic plasticity:LTP,LDP and epilepsy[J].CellMol Life Sci,2000，57:15512611.

[7]Sopala M,Frankiewicz T,Parsons C.Middle cerebral artery occlusion produces secondary,remote impairment in hippocampal plasticity of rats-involvement of N-methyl-D-aspartate receptors[J].Neuroscience Letters,2000,281:143-146.

[8]陈宝贵，赵振发，卞景芝，等.回神颗粒对实验性大鼠局灶性脑缺血缺血区神经细胞凋亡的影响[J].天津中医药，2006，23（3）：227-230.

[9]陈慧娲，刘海东，陈宝贵.回神颗粒治疗急性高血压脑出血的疗效观察[J].天津中医药，2005，22（4）：330.

[10]崔俊波，陈慧娲，李洪艳，等.回神颗粒治疗血管性痴呆临床疗效观察[J].时珍国医国药，2007，18（9）：2166-2167.

[11]Slezak M，Pfrieger FW，Soltys Z.Synaptic plasticity astrocytes and morphological homeostasis[J].J Physiol，2006，99：84-91.