骨质丸Ⅱ中何首乌有效成分的测定

薛爱华，宋文静

（天津市南开区中医医院药剂科，天津 300102）

骨质丸Ⅱ主要由熟地黄、骨碎补、制何首乌、肉苁蓉、墨旱莲、鹿衔草、女贞子、鸡血藤、益智仁、淫羊藿组成，具有补肝益肾，活血化瘀，软坚止痛的功效。本实验选择该制剂中的何首乌所含的有效成分2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷作为定量测定指标，采用高效液相色谱法对何首乌进行含量测定。

1 仪器与试药

仪器：SHIMADZU LC-2010C高效液相色谱仪，CLASS-VP 工作站。对照品：2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷为对照品（中国药品生物制品检定所购置，批号：110844-200505；为含量测定用对照品）；骨质丸Ⅱ样品：本院制剂室提供。

试剂：乙腈，色谱纯；水，去离子水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（17∶83）为流动相；检测波长为 320nm；柱温为40℃；流速为1.0 mL/min。理论板数按2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷峰计算不低于4000。[1]

2.2 检测波长的选择 采用药典检测2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷常用波长320 nm为本实验的检测波长[1]。

2.3 对照品溶液的制备 取2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷为对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。结果见图1。

2.4 供试品溶液的制备 取同一批号（081028）质量差异项下的本品，剪碎，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定质量，加热回流45 min，放冷，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，见图2。

2.5 阴性样品溶液的制备 按处方取除制何首乌的各味药材，按骨质丸Ⅱ制备工艺制得样品，再按“2.4”供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。精密吸取 10 μL，注入液相色谱仪。与 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷为对照品色谱峰相对应的保留时间处，无色谱峰出现，阴性样品溶液无干扰。结果见图3。

2.6 标准曲线的制备 取2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷为对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL含0.0315 mg的溶液作为储备液，分别精密吸取上述对照品溶液各2、4、7、12、18、25 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程：Y=3.9015×106X-32865，r=0.9999。结果表明 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷为对照品在0.0630～0.7875 μg范围内线性良好，结果见表1。

表 1 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷对照品标准曲线Tab.1 The standard curve of control substance of 2,3,5,4,-tetrahydroxy diphenyl ethylene-2-0-β-D-glucoside

2.7 精密度实验 取同一批号（081028）质量差异项下的本品，剪碎，取约2g，按照“2.4”供试品溶液制备操作，按“2.1”色谱条件分析，连续进样6次，测定样品中 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷峰面积，测得峰面积值的相对均数±标准差（RSD）为0.88%，符合要求。

2.8 稳定性实验 取同一批号（081028）质量差异项下的本品，剪碎，取约2 g，按照“2.4供试品溶液制备操作，按“2.1”色谱条件分析，分别在 0、4、8、12、16、20、24 h，测定样品中 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷面积，测得峰面积值的RSD为0.64%，符合要求。

2.9 重现性实验 取同一批号（081028）质量差异项下的本品，剪碎，取约2 g，按照“2.4”供试品溶液制备操作，按“2.1”色谱条件分析，测定每份样品中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷含量。结果样品中 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷平均含量为 0.6312 mg/g，RSD为1.13%，符合要求。

2.10 回收率实验 取同一批号（081028）质量差异项下的本品，剪碎，取约1 g，精密称定，共6份，分别精密加入每 mL 含 0.02576 mg的 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷对照品溶液25 mL，再精密加入稀乙醇 25 mL，再按照“2.4”供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.1”色谱条件分析，计算回收率，结果平均回收率为101.37%，RSD为1.76%。

2.11 样品测定 取另一批号（080811）的样品，按照“2.4”供试品溶液制备操作，按“2.1”色谱条件测定样品中 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷含量。结果平均值（mg/g）为0.6487。

2.12 含量限度的制定 处方中，1 g制何首乌中含2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷mg，参照《中国药典》2005年版一部项下含量限度计算，每 g 含制何首乌以 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷（C20H22O9）计，不得少于 0.04 mg。

3 讨论

本实验分别对入样品进行75%乙醇、稀乙醇提取溶剂进行选择，结果以稀乙醇含量较高，故以稀乙醇为提取溶剂。比较稀乙醇加热回流与超声处理2种提取方法，加热回流结果高于超声处理，故将加热回流提取方式列入为本实验提取方法。又通过对不同加回流提取时间的比较，结果加热回流45 min含量较高，故将提取时间确定为45 min，以此来制备供试品溶液。本方法简便、准确、重现性好。

[1] 国家药检委员会.中国药典一部附录[S].北京：化学工业出版社，2005:33-35.