脊髓损伤大鼠脊髓VRI表达及意义

张 大 范应中 王家祥 张 谦

郑州大学第一附属医院小儿外科 郑州 450052

辣椒素(capsaicin)是一种自红辣椒中提取的香草酰胺衍生物。辣椒素膀胱内灌注通过降低神经原性逼尿肌反射亢进改善尿失禁症状。Caterina等用表达克隆分析的方法在大鼠体内克隆出了第一个和辣椒素发生作用的vanilloid受体1,即VRI。高位脊髓损伤后常引起逼尿肌反射亢进,其脊髓中VRI表达有何变化尚不清楚。本试验研究脊髓横断大鼠脊髓中VRI的表达改变,以期了解VRI表达与逼尿肌反射亢进关系。

1 材料与方法

1.1试剂VRI一抗,兔多克隆 IgG抗体,购自Santa Cruz公司。SP9001免疫组化试剂盒。

1.2实验模型雌性 SD大鼠 50只,体质量 250～280 g。随机分成5组:模型1周组、2周组、3周组、4周组各10只,假手术对照组10只。模型组大鼠腹腔内注射水合氯醛麻醉,胸段背部正中纵切口,咬除 T8、T9棘突,切除椎板,自T8、T9完全横断脊髓后缝合切口。假手术组仅暴露出脊髓后缝合切口。

1.3术后处理所有大鼠术后分笼饲养;术中及术后5 d内腹腔注射氨苄青霉素预防感染,1次/d;术后1周内对所有大鼠均按压腹部辅助其排尿,早晚各1次;1周后,对模型组大鼠每天刺激尿道及肛门周围皮肤引发大鼠排尿,假手术组大鼠自主排尿。模型组大鼠因感染及腹泻等因素死亡7例,1周组死亡1例,2周组死亡2例,3周组死亡1例,4周组死亡3例。

1.4标本取材、染色模型组分别在术后1周、2周、3周、4周取标本。假手术对照组在术后2周取标本。取材时用4℃生理盐水及4%多聚甲醛行主动脉灌注。解剖出脊髓,按照大鼠的脊髓解剖特点,分出各脊髓节段,分别取L4、L5、L6、S1脊髓节段,常规石蜡包埋、4 μ m 切片,免疫组化 SP法染色;每一批染色均设空白对照。

1.5免疫组化结果评价用Image J图像分析系统对免疫组化结果进行分析,以平均灰度值作为测量指标。测量阳性表达的脊髓后角浅层(I层、Ⅱ层)的平均灰度值记作阳性灰度值,与其相邻区域的脊髓灰质的平均灰度值记作背景灰度值,以两者之差的绝对值作为相对灰度值,以相对灰度值作为统计量。

1.6统计学处理数据用均数±标准差(s)表示,应用SPSS 10.0分析软件,对脊髓中VRI表达用两因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1动物术后一般情况观察假手术对照组大鼠手术后活动自如,可自主排尿,无术后腹部隆起及泌尿系感染情况;模型组大鼠术后即出现后肢瘫痪,术后5 d左右出现后腹部膨隆的肿物,为扩大的膀胱,1～2周开始出现反射性排尿,刺激尿道周围皮肤可引发大鼠反射性排尿,同时出现后肢痉挛性瘫痪。

2.2 VRI表达结果假手术对照组和各模型组大鼠脊髓L4、L5、L6、S1各节段中均有 VRI的表达。VRI阳性表达呈棕黄色、深棕色,各节段阳性表达区域局限于脊髓后角浅层(I层、Ⅱ层)的神经纤维。空白对照片中无VRI阳性染色。各组各脊髓节段VRI相对灰度值见表 1。

表1 各组及各脊髓节段VRI表达的相对灰度值 (s)

表1 各组及各脊髓节段VRI表达的相对灰度值 (s)

组别 L4 L5 L6 S1假手术对照组 0.489±0.099 0.992±0.128 2.017±0.255 1.518±0.179模型1周组 0.957±0.139 4.391±0.385 23.416±2.550 13.246±1.643模型2周组 2.509±0.342 9.085±1.243 32.885±6.784 21.384±5.306模型3周组 3.328±0.451 10.132±1.870 36.661±5.741 23.847±4.099模型4周组 3.456±0.663 12.050±1.765 40.206±5.691 27.520±6.316

VRI在各脊髓节段表达不同(F=527.662,P=0.000),两两之间比较差异有统计学意义,表达强度依次为L6＞S1＞L5＞L4;各组之间表达差异亦具有统计学意义(F=227.373,P=0.000)。见图1。

图1

3 讨论

辣椒素具有多种生物学效应,其生理特性之一是选择性作用于感觉神经系统的外周部分,尤其是C型的初级传入神经,可消除自感觉神经末梢释放的P物质等神经递质刺激所产生的疼痛冲动,被广泛应用于疼痛机制和外周疼痛药物治疗等方面的研究[1]。辣椒素膀胱内灌注可增加平均膀胱容量,降低最大膀胱逼尿肌压力,减轻患者逼尿肌反射亢进及尿失禁症状,其治疗效果与辣椒素的浓度具有相关性[2]。

辣椒素与V RI结合后,VRI通道开放,大量的Ca2+和Na+流入神经细胞,而后较高的细胞内Ca2+离子水平引起电压敏感性Ca2+传导,阻断重要的代谢通路,释放聚集在外周神经末梢的神经肽,如P物质和钙基因相关肽[3-4]。因此推测,脊髓损伤后神经原性膀胱的逼尿肌的高反射性与脊髓VRI表达改变有关。

术后假手术对照组和模型组大鼠 L4、L5、L6、S1四个节段脊髓后角中均有VRI阳性表达,L6节段VRI阳性表达最强,S1次之,L5中等表达,L4表达最弱,这说明大鼠膀胱传入神经中C纤维主要传入L6和S1脊髓节段,即大鼠脊髓排尿中枢的感觉传入冲动主要传至L6和S1脊髓节段,大鼠膀胱的脊髓感觉中枢位于L6和S1节段。与其他研究方法得出的结果相同。

除各脊髓节段VRI表达有差异外,假手术对照组和模型组相同一节段VRI表达也存在差异。说明脊髓横断是下位脊髓中VRI表达增强的原因,脊髓损伤后存在某种机制使VRI在膀胱初级传入神经中的表达增加。

脊髓各节段在脊髓横断后V RI的表达增强,并于横断后2周左右基本达到较高水平,这个时间与所观察到的脊髓横断后大鼠自发反射排尿出现的时间相一致;而以前的临床研究也证实,辣椒素膀胱内灌注后患者反射亢进症状消失或减轻,由此可以推测脊髓横断后大鼠膀胱传入神经中VRI表达的增加可能是逼尿肌反射亢进的原因之一。

VRI阳性表达局限于脊髓后角浅层(I层、Ⅱ层)的神经纤维,而后角的神经元未见有VRI阳性表达。这说明脊髓中VRI表达的神经纤维为感觉神经的传入纤维,而感觉传入神经的二级神经元(脊髓后角的神经元)无VRI的表达,也就是说VRI表达在初级传入神经上。由此可知VRI参与了初级传入神经元对外周感觉(膀胱伤害性刺激)冲动的传入。但通过本研究不能确定脊髓后角浅层VRI的合成部位,据推测可能来自于同节段脊髓后根神经节细胞。Sanchez等[5]证实在脊髓后根神经节细胞中有VRI RNA分布。也就是说脊髓后角增加的VRI可能来源于同节段的脊髓后根神经节细胞。因此,脊髓横断后大鼠脊髓后角浅层VRI表达增强,可能是膀胱逼尿肌反射亢进的原因之一。

[1]M ark Hayman,Peter CA.Capsaicin:A review of its pharmacology and clinical applications[J].Current Anaesthesia&Critical Care,2008,19:338-343.

[2]Daniel N,Cortright,Arpad Szallasi.The role of the vanilloid and related receptors in nocicepto r function and neuroimmune regulation[J].Neuro Immune Biology,2009,8:101-117.

[3]Szallasi A,Fowler CJ.After a decade of intravesical vanilloid therapy:still more questions than answers[J].Lancet Neurol,2002,1:167-172.

[4]Sanchez JF,Krause JE,Cortright DN.The distribution and regulation of vanilloid receptor V RI and VRI 5'splice variant RNA expression in rat[J].Neuroscience,2001,107(3):373-381.