响应曲面法优化微波辅助提取葎草总黄酮的工艺研究

董江涛，李 燕，徐慧强，蒋橙华

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

葎草[Humulus scandens（Lour.）Merr.]为桑科葎草属草本植物[1]。野生于田间路边，又名乌爪龙、拉拉藤、过肤龙等，广泛分布于我国大部分地区[2]。药理研究证明，其具有抗茵、抗炎、止泻抑菌、降压、镇痛等作用[3]。已报道的从葎草全草中分离出的主成分为黄酮类化合物[4]。但是，葎草黄酮的提取鲜有报道，并且提取得率差别很大，因此本研究期望通过响应曲面法的优化，在获得较高的提取得率同时，也测定出葎草中黄酮的含量。

微波辅助提取技术是利用微波场的生物效应、热效应及“扰动”效应来加速物质的扩散溶解，有效地提高化合物提取的得率与含量。微波辅助提取技术用于黄酮类化合物的提取时具有选择性高、提取时间短、溶剂用量少、后处理方便耗能低、对环境安全无害等优点[5]。试验以黄酮的提取得率为指标，对微波功率、提取时间和液料比的单一和交互作用等进行研究，应用响应面法对微波提取葎草黄酮的条件进行优化，以期得到微波辅助提取的最佳工艺参数，为葎草黄酮的提取及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葎草：11月中旬采自安徽亳州，自然晾干；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WFZ-UV2000紫外可见分光光度计，（尤尼柯仪器有限公司）；XH-MC-1微波催化合成萃取仪（北京祥鹄高科技发展有限公司）；sartorius BS210S电子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；多功能粉碎机（广东佛山市方胜电器有限公司）；高速冷冻离心机（H2050R-1长沙湘仪离心机仪器有限公司）；微量移液枪（德国Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 制备提取液 葎草60℃恒温烘干，粉碎，过20目筛，准确称取块状碎片1.0 g，加入60%乙醇，微波辅助提取，提取液经抽滤、离心后于50 mL容量瓶中以60%乙醇定容，摇匀待用。

1.3.2 芦丁标准曲线制作 准确称取0.010 0 g芦丁标准品以60%的乙醇溶解后，定容到50 mL容量瓶中得到0.200 mg/mL的芦丁标准液。分别准确量取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 此标准液于8个25 mL容量瓶中，依次分别加入1.0 mL 5%的NaNO2溶液，摇匀后静置6 min；1.0mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀后静置 6 min；10.0 mL 4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀释到刻度，静置15 min。在510 nm处测定吸光度（A），以浓度（mg/mL）为横坐标，A为纵坐标作标准曲线[10]。

1.3.3 总黄酮含量测定与计算 黄酮含量测定采用硝酸铝络合分光光度法，其原理是黄酮类化合物经亚硝酸钠还原后，与硝酸铝络合生成稳定的红橙色化合物，此化合物在510 nm处有最大吸收，然后以芦丁作标准，通过测定吸光度计算含量。

准确移取1.0 mL的样品液于50 mL容量瓶中，其余操作同1.3.2标准曲线制作。根据标准曲线换算，按以下公式计算总黄酮得率。

1.3.4 单因素试验设计 分别考察了微波功率、液料比、提取时间、乙醇浓度等4个因素，在各自5个水平上的提取得率，具体参数见表1。

表1 单因素试验考察因素及水平

（1）微波功率对提取得率的影响。在液料比20∶1、提取时间20 min、乙醇浓度60%的条件下，考察微波功率对葎草黄酮提取得率的影响。

（2）提取时间对提取得率的影响。在液料比20∶1、乙醇浓度60%、微波功率为420 W的条件下，考察提取时间对葎草黄酮提取得率的影响。

（3）液料比对提取得率的影响。在提取时间20 min、乙醇浓度60%、微波功率为420 W条件下，考察液料比对葎草黄酮提取得率的影响。

（4）乙醇浓度对提取得率的影响。在液料比20∶1、提取时间20 min、微波功率为420 W条件下，考察乙醇浓度对葎草黄酮提取得率的影响。

1.3.5 响应曲面设计 应用Box-Behnken设计方案对单因素试验结果做响应曲面研究，建立葎草黄酮提取得率的二次多项式数学模型。三个自变量微波功率、提取时间和液料比分别以X1、X2和X3代表，以＋1、0、－1分别代表各自的不同水平，每个变量按方程进行编码。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长。试验模型可用二次多项式表达为：

Y 为葎草黄酮提取得率的响应值，Ai、Aii、Aij为模型的相关系数，Xi、Xj（i≠j）为自变量编码值，响应面法设计的编码因素及水平见表2。

表2 响应面法分析因素及水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线

从图1中可以看出，芦丁标准曲线回归方程为：A=9.412 2C－0.005 4（R2=0.999 7），其中 C 为黄酮浓度（mg/mL），A为吸光度，线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 微波功率对提取得率的影响 由图2中可知：在较低的微波功率条件下，黄酮的提取率随微波功率的增强而显著增加，但微波功率达到420 W后，黄酮提取率会降低，是因为过高的微波功率下温度升高明显，使得蛋白质变性，阻碍了黄酮的溶出。此外乙醇会沸腾，沸腾的乙醇蒸汽冷凝回流的时间过程间接地缩小了液料比，使得乙醇与葎草没有充分接触，黄酮没能完全溶出。

图1 芦丁标准曲线图

图2 微波功率对提取得率的影响

2.2.2 提取时间对提取得率的影响 在10～25 min的时间内，随着提取时间的延长，总黄酮的得率不断升高，浸提时间在25 min时，黄酮提取得率达到最大值，25 min后开始下降。原因是浸提起始时，葎草与溶剂接触充分，黄酮能够充分溶解，但随着时间的延长，微波会促进黄酮的氧化，因此，葎草黄酮较佳的提取时间为25 min。

2.2.3 液料比对提取得率的影响 从图4可以看出，当液料比从10∶1扩大至20∶1时，总黄酮的得率增加趋势非常明显，在20∶1时达到最大值，之后开始减小，这是由于液料比扩大可以增加物料与溶剂的接触面积，使得黄酮类物质更充分的溶解出来，过多的溶液会吸收微波从而降低了微波对黄酮溶解的促进作用。另外液料比过大也会溶解出过多的杂质，不仅耗损了大量的试剂，也给后来的纯化工作带来困难，所以确定最佳液料比为20∶1。

图3 提取时间对黄酮提取得率的影响

图4 液料比对黄酮提取得率的影响

2.2.4 乙醇浓度对提取得率的影响 由图5可知随着乙醇浓度的升高，总黄酮得率随着升高，当乙醇浓度达到60%时，总黄酮得率达到最大值。随着浓度进一步提高，总黄酮含量逐渐降低。是因为乙醇浓度过高时，一些亲脂性强的成分等溶出增多，并与总黄酮竞争地与乙醇-水分子结合，干扰黄酮的溶出。

图5 乙醇浓度对黄酮提取得率的影响

2.3 响应曲面优化试验

2.3.1 模型建立及显著性检验 响应面设计中，以微波功率、提取时间和液料比为参数，葎草黄酮的提取得率为响应值，进行了3因素3水平响应面分析试验。试验结果见表3。

由表3可知，试验值与预测值很接近，模型适应性高。利用Design Expert 7.0.0软件对数据进行二次多元回归拟合，得到葎草黄酮提取得率（Y）对编码自变量：微波功率（X1）、提取时间（X2）和液料比（X3）之间的二次多项回归方程：

表3 响应曲面试验结果

Y=1.82+0.068 X1+0.040 X2+0.043 X3－0.046 X1X2－0.066 X1X3－0.033 X2X3－0.17 X12－0.078 X22－0.085 X32。

从表4黄酮得率回归模型方差分析（ANOVA）可以看出：F回=21.9＞F0.01（9.4）=14.8，p=0.000 3，表明模型极其显著。黄酮得率F失拟=1.04＜F0.05（9.3）=8.81，失拟项p=0.47＞0.05，表明失拟不显著。模型一次项微波功率（X1）（p=0.001 6）、提取时间（X2）（p=0.027 7）、液料比（X3）（p=0.016 2）显著；二次项均显著；交互项X1X2（p=0.047 6）、X1X3（p=0.011 0）；X2X3（p=0.130 4）不显著。

表4 回归方程系数及显著性检查

Design Expert软件中Box-Behnken法计算葎草黄酮得率回归模型的调整确定系数（AdjR-squared）RAdj2=0.9217，即该模型能解释92.17%响应值的变化，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，说明响应曲面法优化葎草总黄酮的提取条件是可行的。

2.3.2 响应曲面分析 利用Design Expert 7.0.0软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的等高线及其响应面见图6～8。根据二次模型所得到的等高线及响应曲面的形状可以评价试验因素之间的交互作用强度，以及确定各因素的最佳水平范围。

由图6可知：当液料比为20∶1，提取时间不变的条件下，微波功率在400W～420W范围内增大时，葎草黄酮提取得率急剧增加，并在420 W附近达到极大值而后缓慢降低，与单因素试验结果吻合。

图6 提取时间、微波功率的等高线和响应曲面图

由图7可知：提取时间不变的条件下，固定微波功率，曲线呈现陡峭增加后平滑递减的规律，说明液料比在较低的水平下对葎草黄酮提取得率影响大于较高水平下的影响。

图7 微波功率、液料比的等高线和响应曲面图

由图8可知：微波功率固定的条件下，液料比不变的情况下，葎草黄酮提取得率受提取时间的影响显著，表现为先升高后降低的较陡曲线。

图8 提取时间、液料比的等高线和响应曲面图

等高线的形状可反映出因素间交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，而圆形则相反。响应曲面坡度的陡峭程度表现响应值对因素变化的敏感性。图6、图7可以看出等高线呈椭圆，说明提取时间和微波功率、微波功率和液料比之间交互影响显著，响应面陡峭说明提取得率对提取时间、微波功率和液料比的变化敏感[6-9]。

对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即3个主要因素的最佳水平值，转换后得到提取的最佳条件为：微波功率422.81 W、提取时间25.89 min、液料比20.82∶1，此时葎草总黄酮的得率达1.83%。

2.4 模型验证

对试验进行验证，选择的条件为微波功率420 W.、提取时间为 26 min、液料比 21∶1，黄酮的得率分别为 1.68%、1.74%、1.72%、1.69%、1.75%，平均为1.73%，数据重现性良好，偏差不大，吸光度测量值稳定说明每次测定的黄酮含量稳定，证明该结果是合理可靠的。

3 结论

试验通过响应曲面法的优化，得到了影响微波辅助提取葎草黄酮的各因素的显著性，以及因素之间相互作用的关联程度，并且得到了提取的最佳作用条件：微波功率422.81 W、提取时间25.89 min、液料比20.82∶1，此时葎草总黄酮的得率达1.83%，模型经验证后结果稳定偏差不大，说明响应曲面法优化提取葎草黄酮是可行的。

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