欧文氏杆菌CXJZ95-198甘露聚糖酶基因N端缺失表达

李 炫，彭克勤，刘正初

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410006）

甘露聚糖酶是一种重要的工程酶，能降解甘露聚糖、木质素等物质，在纺织、造纸、饲料、食品、石油开采等诸多领域都有重要用途[1]。该酶在对草本植物纤维提取中半纤维素的降解方面起着举足轻重的作用[2]。中国农科院麻类研究所工程酶实验室筛选到的欧文氏菌CXJZ95-198具有较高的甘露聚糖酶活性，张运雄等克隆到其甘露聚糖基因manA，分析发现manA基因的DNA序列与其他DNA序列同源性很低[3-4]。本研究构建了N端缺失片段的表达载体，初步研究了manA N端部分序列的功能，旨在为以后改造甘露聚糖酶基因提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 欧文氏杆菌CXJZ95-198，大肠杆菌E.coliBL21（DE3），载体pET 28 a由中国农业科学院麻类研究所工程酶实验室保存。

1.1.2 工具酶及主要试剂BamHI、HindIII、T4连接 酶 、PCR Supermix、DNA mark III 等 均 购 自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及目的基因的PCR扩增 如表1所示，根据GenBank报道的甘露聚糖酶基因序列（DQ364440）设计了以下5个引物，均由上海生工合成。用PCR方法对CXJZ95-198全基因组DNA进行扩增，PCR反应参数为：94℃预变性3 min，94℃，变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 60 s，30 个循环，最后72℃ 延伸 10 min，冷却至4℃。

1.2.2 manA及缺失片段突变体的获得 将PCR扩增产物经电泳检测、胶回收后，分别用BamHI和HindIII进行双酶切，37℃酶切3 h，回收目的片段，连入pET 28 a载体。连接过夜体系如下：1 μL pET 28 a载体，5 μL 目的 DNA，1 μL T4 DNA 连接酶，3 μL dd H2O。连接产物通过42℃热激转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞里，37℃ 恢复培养1 h后涂于含50 μg/mL卡那霉素的选择性LB平板上，倒置37℃培养过夜。

表1 引物设计

1.2.3 表达载体的鉴定 用BamHI和HindIII对重组质粒进行双酶切，37℃反应3 h，电泳检测酶切。

1.2.4 表达载体在大肠杆菌里的表达与甘露聚糖酶活性的鉴定 挑取阳性克隆子接种于含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养5 h，点种于甘露聚糖酶筛选平板上，37℃培养过夜，观察透明圈产生情况。

1.2.5 重组子表达产物SDS-PAGE分析 对重组子表达产物进行SDS-PAGE分析，参照文献[5]进行。

2 结果与分析

2.1 缺失表达载体的构建

质粒在酶切以前是闭环拓扑结构，无法被凝胶电泳反映其真实大小，但被限制性内切酶切成线性形状后，它的长度可以在电泳图中反映出来，图1是pET 28 a在BamHI和HindIII双酶切后的1%琼脂糖凝胶电泳检测图，条带大小约是5 000 bp左右，与pET 28 a质粒的实际大小5 361 bp相符。

以CXJZ95-198基因组为模板，如表2所示，按目的片段 pF1（F1/R1）、pF2（F2/R1）、pF3（F3/R1）、pF4（F4/R1）加入相应的正反引物进行扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图2），结果表明目的片段扩增特异性很好，浓度合适。

表2 扩增缺失片段的对应引物以及扩增产物大小

2.2 缺失表达载体的质粒酶切鉴定结果

分别提取能在含有卡那霉素的LB培养平板中生长的pF1-pF4转化子的质粒，5 μL质粒加入BamHI和HindIII 37℃保温2 h后用凝胶电泳验证。如图3所示，1～4泳道中4 500 bp以上的条带是大小为5 000 bp左右的pET 28 a质粒，1 200～800 bp之间呈梯度排列的条带是pF1-pF4 DNA片段，说明所挑取的转化子为阳性转化子。

2.3 重组子的甘露聚糖酶活性活性鉴定

挑取pF1-pF4转化子的典型菌落点在甘露聚糖酶筛选培养基上，37℃培养过夜，观察各转化子在甘露聚糖筛选培养基上所表现的透明圈可初步判断该转化子的产酶情况。如图4所示，阳性对照欧文氏杆菌CXJZ95-198产酶能力很高，生成的水解圈比其他各缺失表达体系都大，说明该酶在大肠杆菌高效表达体系中优势不明显。阴性对照大肠杆菌E.coliBL21（DE）不分泌甘露聚糖酶，不产生透明圈。4个缺失表达体系横向对比，pF1透明圈最大，pF2和pF3酶活性较pF1大幅下降，pF4没有甘露聚糖酶活性，pF1和pF2横向对比说明缺失了的信号肽序列对酶活或者酶的分泌能力有负面影响，pF2和pF3透明圈大小无明显差异说明N端信号肽后10个AA对该酶的活性无影响，可删除。pF4和pF3比较说明pF4多删除的10个AA对该酶的活性有非常重要的影响。

2.4 重组子表达产物的SDS-PAGE分析

分别挑取pF1-pF4四种菌的阳性克隆子的单菌落，在5 mL含有终浓度为50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃，180 r/min震荡培养6 h，再将活化菌按2%的比例接种100 mL含有同样浓度的卡那霉素LB培养基中扩大培养，OD600=0.6时加入0.8 mM的IPTG诱导表达，20 h后分别收集菌体跑SDS-PAGE电泳。

如图5所示，在45 kD左右能很清晰地看到很明显的蛋白条带，比其他条带浓很多，大小与预测的大小相符，可以认为是目的蛋白带，pF1-pF4的蛋白带由大到小成成的梯度反应了依次缺失的序列所翻译的蛋白质大小依次缩小。与目的期望相符，pF1强表达两条带，大小相差不多，除了预测在45 kD以上的那条带以外在小于45 kD的地方也强表达一条带，从氨基酸序列信号肽预测得知manA N端前27个AA为信号肽序列，pF1包含了信号肽序列，pF2-pF4都缺失了信号肽序列，所以pF1的胞内蛋白存在分泌途径已切除信号肽和未切除信号肽，有两条带，其他重组子胞内表达产物只有一条带。

3 结论

本研究成功构建了4种不同的表达载体，分别是pF1（manA全长），pF2（N端27个AA缺失），pF3（N端37个AA缺失），pF4（N端47个AA缺失）。用甘露聚糖酶筛选培养基检测发现，pF4不表现出甘露聚糖酶活性，pF3，pF2都表现出较弱酶活性，pF1酶活性最高，但也低于原始菌CXJZ95-198，表明ManA N端37-47个AA可能对该酶结构或活性有重要影响。N端27-37个AA缺失对该酶无明显影响，N端信号肽缺失对该酶的分泌有较大负面影响。在对蛋白SDS-PAGE胶进行研究时发现pF1表达两条带，大小相差不多，除了预测在45 kD以上的那条带以外在小于45 kD的地方也强表达一条带，胞外分泌蛋白重量最大的pF1却比pF2，pF3，pF4的蛋白条带小，甚至小于45 kD。推测因为pF1包含了信号肽序列，pF2－pF 4都缺失了信号肽序列，所以pF1的胞内蛋白存在分泌途径已切除信号肽和未切除信号肽，有两条带。胞外分泌蛋白只表示切除信号肽分泌到胞外的，所以只有一条带。

[1]吴 襟.微生物 β-甘露聚糖酶 [J].微生物通报，1999，26（2）:134-136.

[2]刘正初.麻类纤维提取工程微生物研究回顾与展望[J].中国农业科学，2007，40（增刊）：1363-367.

[3]yunxiong Z，zhengchu L，Xinbo C.Cloning and expression of a mannanase gene from Erwinia carotovora CXJZ95-198[J].Annals of microbiology，2007，57（4）：623-628.

[4]张运雄.麻类生物脱胶与生物制浆酶系[J].中国麻作，2003，24（2）：14-17.

[5]张龙翔，张廷方，李令媛.生化试验方法与技术 [M].北京:高等教育出版社，1997.