饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化

周映华，吴胜莲，贺月林，缪 东

（湖南省微生物研究所，湖南 长沙 410009）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）基我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多的研制成微生物制剂。其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，具有广阔的发展前景，现已在畜牧业、饲料行业中广泛应用，显示出了巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力，这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病，促进生长起到重要作用。目前在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。笔者对枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件进行了研究，以期提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 种 供试菌种为枯草芽孢杆菌，由湖南省微生物研究所菌种保藏室提供。

1.1.2 培养基 检测培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，葡萄糖1%，氯化钠0.5%，琼脂2%；种子培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0～7.2；基础发酵培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、大豆粕1%、淀粉0.3%、3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%。pH均调为7.0～7.2。

1.1.3 仪器设备 供试仪器：SHP-250生化培养箱、1600倍微生物显微镜、PHS—25型数显酸度计、福玛QYC—211摇床、电热鼓风干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 发酵培养基的优化 采用四因素三水平L9（34）的正交实验，对枯草芽孢杆菌发酵培养24 h后，通过稀释平板计数法测定活菌数，芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数比较。光密度（OD600）值测定采用光电比浊计数法，以活菌数的高低作为评价培养基优劣的指标。

1.2.2 发酵条件的优化 （1）温度对生长量的影响：选取20、25、30、35、37、40℃ 6 个温度作为摇床发酵温度，在初始pH 7.0，转速220 r/min条件下培养24 h，测定其OD600值。（2）起始pH值对生长量的影响：将培养基的初始 pH 调至 5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0，在接种量5%，温度30℃，转速220 r/min条件下培养24 h，测定其OD600值。（3）转速对生长量的影响：选取 150、200、220、250、300 r/min 5个转速，在发酵液初始pH 7.2，温度30℃条件下培养24 h，测定其OD600值。（4）接种量对生长量的影响：选取接种量 1%、3%、5%、7%、10%、15%，在30℃，初始pH 7.2，转速220 r/min条件培养24 h，测定其OD600值。

1.2.3 发酵罐试验 在摇瓶优化的基础上，进行了20 L发酵罐的扩大培养。发酵培养条件为：初始pH 7.0～7.2，温度 30℃，转速 220 r/min，121℃灭菌30 min，起始气流量比l∶0.5。镜检芽孢率达到85%以上时，发酵结束。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的优化

由表1可见，对枯草芽孢杆菌发酵影响的次序为：豆粕＞淀粉＞葡萄糖＞硫酸锰，即豆粕对菌体增殖的影响最大，其次是淀粉、葡萄糖，最后为硫酸锰。优化后的发酵培养基为：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、3.08%硫酸锰0.2ml、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%。

表1 正交试验

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 温度对生长量的影响 由图1可见，在20～30℃时，随着温度的升高，OD600值升高。在30℃时OD600值最大，高于30℃时，OD600值反而下降，因而枯草芽孢杆菌的最适生长温度为30℃。

图1 不同温度对枯草芽孢杆菌生长量的影响

2.2.2 起始pH值对生长量的影响 发酵过程中pH难以控制，一般控制发酵液的初始pH。由图2可见，枯草芽孢杆菌的适宜pH范围为7.0～7.2。

2.2.3 转速对生长量的影响 枯草芽孢杆菌是需氧菌，通过改变转速可以调节通气量。转速太小，通气量小，不利于菌体生长，转速太大时，菌体生长量反而减少。由图3可见，随着转速的提高，OD600值升高。超过220 r/min后，其OD600值反而下降。枯草芽孢杆菌的最适转速为220 r/min。

图2 不同pH对枯草芽孢杆菌生长量的影响

图3 不同转速对枯草芽孢杆菌生长量的影响

2.2.4 接种量对生长量的影响 由图4可见，随着接种量的增加，其OD600值升高，超过10%的接种量后，OD600值反而下降，因此枯草芽孢杆菌的最适接种量为10%。

图4 不同接种量对生长量的影响

2.3 发酵罐试验

发酵罐试验结果表明：发酵周期与摇瓶发酵基本一致，含菌量达1.58×1010个/mL，放罐时间20～22 h。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此菌体浓度和芽孢形成率都比摇瓶发酵好。

3 结论

采用正交实验法对枯草芽孢杆菌的培养基进行了优化，通过稀释平板计数法测定其培养24 h后的活菌数，以活菌数的高低作为评价培养基优劣的指标。优化后的培养基为：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、3.08%硫酸锰0.2 mL。并通过单因素实验法确定了最佳培养条件为：温度30℃，初始 pH 7.0～7.2，转速 220 r/min，接种量 10%。进行了发酵罐放大培养，最适放罐时间20～22 h，获得的菌体数量约为1.58×1010个/mL，为大规模工业化发酵培养提供了有益借鉴。

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