Taqman三重实时PCR快速检测原料乳中致泻性大肠埃希氏菌

张红宇，孟祥晨，姜 博，张伟钦

（乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

通常将致泻性大肠埃希氏菌分为五大类，肠致病性大肠埃希氏菌（Enteropathogenic E.coli，E PEC）、肠产毒性大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（Enteroin-vasive E.coli，EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）以及肠集聚性大肠埃希氏菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）[1]。致泻性大肠埃希氏菌的致病症状主要是引发不同程度的腹泻，其感染剂量一般为106～108cfu[2]。

近年来，各国由致泻性大肠埃希氏菌引起的食物中毒事件时有发生。1996年6月到12月，日本爆发O157∶H7大肠埃希氏菌感染事件，出现了大量食物中毒病人，感染期间全国共中毒9451人，死亡6人[3]。南昌市1998年8月发生一起由肠侵袭性大肠埃希氏菌[EIEC O124∶ K72（B17）]引起的食物中毒爆发，致27人发生感染性腹泻病[4]。青岛市区东部某乡镇由ETEC引起的井水污染，从2006年9月17日出现首例病人至9月29日出现最后1例发病病人，共发现169例患者出现恶心、呕吐、腹痛、发热等症状并伴有大量水样腹泻[5]。在各起致泻性大肠埃希氏菌感染事件中，最常见的有三种，即EPEC、EIEC、ETEC，针对基因型的检测通常采用eae、ipaH、lt和st基因[6-9]。对于ETEC，相对于st、lt是更主要的毒素。本研究即针对以上3种常见的致泻性大肠埃希氏菌的三种致病基因，采用Taqman探针检测技术，建立了可快速检测原料乳中致泻性大肠埃希氏菌三重实时PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器与主要试剂

7500实时荧光PCR仪和9700PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；凝胶成像系统（美国UVP公司）；1360型生物洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；TaqDNA聚合酶、dNTPs和细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；致泻性大肠埃希氏菌诊断血清试剂盒（宁波天润生物药业有限公司）。

1.1.2 菌株与培养基

肠致病性大肠埃希氏菌44706、肠侵袭性大肠埃希氏菌44350和单增李斯特菌NICPBP54002（中国药品生物制品检定所）；肠产毒性大肠埃希氏菌CVCC197（中国兽医药品监察所）；大肠埃希氏菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923（黑龙江省应用微生物研究所）；荧光假单胞菌As1.1082（中国科学院北京微生物研究所）；枯草芽孢杆菌ATCC6051（中国普通微生物菌种保藏中心）；植物乳杆菌KLDS1.0314和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028（均由本实验室保存）。大肠埃希氏菌的继代培养使用LB培养基，分离鉴别培养使用伊红美兰琼脂培养基，其他参考菌株选择营养肉汤液体培养基。

1.1.3 原料乳来源

采自哈尔滨市周边农场及农户的原料乳。

1.2 引物与探针

依据文献[10]针对eae致病基因设计的引物和探针分别由上海Invitrogen公司和大连TaKaRa有限公司合成，其探针的发光基团和淬灭基团分别为JOE和TAMRA；依据文献[11-12]针对ipaH致病基因设计的引物和探针分别由上海Invitrogen公司和大连TaKaRa有限公司合成，其探针的发光基团和淬灭基团分别为FAM和BHQ1；依据文献[13-14]针对lt致病基因设计的引物和探针均由上海Invitrogen公司合成，其探针的发光基团和淬灭基团分别为CY5和BHQ2。具体序列见表1。

表1 所用引物和探针Table 1 PCR primers and TaqMan probes used in this study

1.3 方法

1.3.1 原料乳中细菌基因组DNA的提取

为降低乳中所含物质对DNA提取纯度的影响，本文对Rademaker的方法[15]进行了改良：取1 mL待测原料乳，加入150 μL 18%（W/V）的柠檬酸钠和 100 μL 4%（W/V）NaOH，10 000 r·min-1离心 10 min，收集菌体细胞，加入1 mL PBS缓冲液吹打沉淀，于12 000 r·min-1离心2 min，弃上清，再加入1 mL 1×TE 吹打沉淀，于 12 000 r·min-1离心 2 min，弃上清，将收集到的菌体用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.3.2 Taqman三重实时PCR方法的反应条件

本试验选用50 μL反应体系，具体组分为：3 U的 Taq DNA 聚合酶，10×PCR缓冲液（无 Mg2+）5 μL，dNTPs（各2.5 mmol·L-1）5 μL，Mg2+（25 mmol·L-1）5 μL，EPEC、EIEC 和 ETEC 模板各 2 μL，Rox参比染料（1×）1 μL，eae探针（10 μmol·L-1）2.0 μL，ipaH探针（10 μmol·L-1）1.8 μL，lt探针（10 μmol·L-1）1.2 μL， eae 上下游引物（10 μmol·L-1）各 2 μL，ipaH 上下游引物（10 μmol·L-1）各 3 μL， lt上下游引物（10 μmol·L-1）各 3 μL。

所确定的三重Taqman荧光PCR体系的循环参数为：

有下划线的步骤表示在此阶段末端收集荧光信号。

1.3.3 人工污染致泻性大肠埃希氏菌乳样的制备

将EPEC或EIEC或ETEC培养液按照1%接种量接种于超高温灭菌乳中，37℃，200 r·min-1振荡培养16 h，即为人工污染乳样。

1.3.4 特异性检测

以EPEC 44706、EIEC 44350和ETEC CVCC197的DNA为阳性模板，以大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、单增李斯特菌NICPBP54002、植物乳杆菌KLDS1.0314、荧光假单胞菌As1.1082和枯草芽孢杆菌ATCC6051的DNA为阴性模板，建立11个三重PCR反应体系，第1个反应管中加入EPEC、EIEC和ETEC的DNA，第2～4个反应管中分别加入EPEC、EIEC和ETEC两两组合的DNA，第5～11个反应管中分别加入7种阴性对照的DNA，同时以去离子水做空白对照，进行同一批次的三重实时PCR扩增，检测各个反应中JOE、FAM和CY5荧光基团有无指数期增长变化，以此判定本试验所采用引物及探针的特异性是否良好。

1.3.5 灵敏度检测

将已知 EPEC 含量（约为 4.30×107cfu·mL-1）的乳样加入到一系列灭菌原料乳中，分别调节乳样中EPEC 浓 度 约 为 4.30 ×106、 4.30 ×105、 4.30 ×104、4.30×103、4.30×102、2.15×102、1.08×102、4.30×101和 4.30×102cfu·mL-1；将已知 EIEC 含量（约为2.81×108cfu·mL-1）的乳样加入到一系列灭菌原料乳中，分别调节乳样中 EIEC浓度约为2.81×107、2.81×106、2.81×105、2.81×104、2.81×103、2.81×102、1.41×102、2.81×101cfu·mL-1；同样，将已知ETEC 含量（约为 1.08×108cfu·mL-1）的乳样加入到一系列灭菌原料乳中，分别调节乳样中ETEC浓度约 为 1.08 ×107、 1.08 ×106、 1.08 ×105、 1.08 ×104、1.08×103、5.40×102、2.70×102、1.08×102、1.08×101cfu·mL-1。再按照1.3.1方法分别提取上述乳样中细菌基因组DNA，提取的DNA分别用Taqman三重实时PCR进行扩增，根据扩增曲线的形态及Ct值确定该方法的检测限。

同时分别将菌含量均约为1 cfu·mL-1的EPEC、EIEC和ETEC乳样置于37℃，200 r·min-1摇床培养，分别于培养0、1、2和3 h后各取1 mL，按照1.3.1方法提取细菌基因组DNA，所提DNA用于Taqman荧光PCR扩增，以确定当检测限为1 cfu·mL-1时的增菌时间。

1.3.6 重复性检测

将 37 ℃振荡（200 r·min-1）培养 16 h后，已知 EPEC浓度约为 4.30×107cfu·mL-1，EIEC浓度约为 2.81×108cfu·mL-1，ETEC 浓度约为 1.08×108cfu·mL-1的3种乳样，分别进行10和100倍稀释，按照1.3.1方法分别提取乳样的基因组DNA，每种菌株各得到3组浓度不同的DNA模板，按照已经确定的1.3.2方法对3组不同浓度的DNA进行批内和批间重复性检测。在批内重复性检测中，DNA模板选取以上3种浓度；在批间重复性检测中，DNA模板只选取一种浓度（所对应的ETEC的浓度约为1.08×108cfu·mL-1，EIEC 的浓度约为 2.81×107cfu·mL-1，EPEC浓度约为4.30×105cfu·mL-1），分5批次重复进行PCR反应。以上每一种反应体系均同时做3个重复，最后对获得的Ct值进行汇总，通过计算样品不同Ct值的变异系数来评定该方法的重复性。

1.3.7 原料乳中致泻性大肠埃希氏菌的检测

采集哈尔滨市内及周边地区小型奶牛场或奶牛养殖户共38份原料乳样品，于37℃，200 r·min-1摇床培养2 h后，按照1.3.1方法提取DNA，所提取的DNA按照1.3.2方法进行三重荧光PCR扩增。同时采用中华人民共和国国家标准GB/T 4789.6-2003文献[6]。比较国标方法和本研究所建立方法的检测结果。

2 结果与分析

2.1 特异性检测

三种原料乳中常见的致泻性大肠埃希氏菌和7种阴性对照菌株经三重实时PCR检测后结果见图1。每个反应管中均含JOE、FAM和CY5（分别代表eaeP、ipaHP和ltP探针的荧光信号）3种荧光探针，管与管之间的区别在于DNA种类的不同。管1中含有三种菌的DNA，对管1检测到3条荧光曲线，一条为JOE荧光形成，一条为FAM荧光形成，另一条为CY5荧光形成。管2中有EPEC和EIEC两种菌的DNA，故只有两条荧光曲线。管3中只有EIEC和ETEC两种菌的DNA，故只有FAM和CY5的荧光曲线。管4中只有EPEC和ETEC两种菌的DNA，故只有JOE和CY5的荧光曲线。管5～11分别为其他菌的DNA，均未检测到荧光增加信号，表现为阴性。由此看出，三重荧光PCR反应时3种探针的荧光扩增曲线，与3种探针两两组合反应时并无明显区别，也说明引物和探针与其他致病菌无交叉反应，三重荧光PCR具有良好的特异性。

图1 以目的菌株DNA与阴性对照菌株DNA为模板的Taqman三重实时PCR扩增Fig.1 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with DNA of target strains and negative control strains

2.2 灵敏度检测

从图2可以看出，当EIEC含量在2.81×108～1.41×102cfu·mL-1时，均能检测到荧光信号和Ct值，但在EIEC含量为1.41×102cfu·mL-1时，扩增曲线已经不明显，且Ct值为32.67，明显大于30，因此，Taqman三重实时PCR对EIEC的检出限可达到2.81×102cfu·mL-1，同理可得出，Taqman 三重实时PCR对EPEC的检出限可达到2.15×102cfu·mL-1（见图3），对ETEC的检出限可达到5.40×102cfu·mL-1（见图 4）。

图2 Taqman三重实时PCR对不同浓度的EIEC的扩增Fig.2 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing EIEC of different concentrations

图3 Taqman三重实时PCR对不同浓度的EPEC的扩增Fig.3 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing EPEC of different concentrations

此外，由于通常致泻性大肠埃希氏菌在原料乳中的数量较小，甚至达到每毫升个位的数量，所以需要对采集的原料乳进行一定时间的前增菌处理，以提高该方法于实际应用中的可行性，并且可以通过缩短增菌时间的方式，来达到快速检测的目的。将3种原始菌体浓度均为1 cfu·mL-1的奶样于摇床培养2 h后提取细菌基因组DNA，然后进行Taqman三重实时PCR，即可出现典型S型扩增曲线。说明该方法在2 h增菌处理后检测限可达到 1 CFU·mL-1。

2.3 重复性检测

表2是3种不同浓度的模板批内重复性试验的Ct值结果。从表2可看出，虽然3组中所用DNA浓度不同，但各自扩增Ct值的SD和CV值都较低，CV值均小于5%，说明用不同浓度的DNA所做的Taqman三重荧光PCR扩增所得结果稳定可靠。在同一菌体范围内，随着菌体浓度的减小，SD和CV值有上升趋势，即稳定性降低，所以在应用此方法时要尽量提高菌液浓度以减小误差提高稳定性。

图4 Taqman三重实时PCR对不同浓度的ETEC的扩增Fig.4 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing ETEC of different concentrations

表2 所建立的Taqman三重实时PCR法的批内重复性检验的Ct值

表3为批间重复性试验结果，该表中显示的CV值均在合理的范围内（CV＜5%）。虽然EIEC的浓度比ETEC低，但Ct值是最小的，说明EIEC的扩增最为理想。

批内和批间的重复性试验结果说明，该试验的稳定性和重复性较好。

2.4 市售原料乳中致泻性大肠埃希氏菌的检测

分别采用国标GB/T 4789.6-2003的方法和Taqman三重实时PCR方法检测所采集的38份原料乳样品，两种方法所获得结果高度一致：均共检出致泻性大肠埃希氏菌10株，其中EPEC 4株，ETEC 4株，EIEC 2株。说明本试验所建立的Taqman三重实时PCR检测原料乳中致泻性大肠埃希氏菌的方法准确可行，且Taqman三重实时PCR方法检测样品只需6 h即可完成全部过程，操作简便，而国标GB/T 4789.6-2003方法检测样品需耗时4～5 d。

表3 所建立的Taqman三重实时PCR法的批间重复性检验的Ct值Table 3 Threshold cycle value of inter-assay of reproducibility test of Taqman triplex real-time PCR

3 讨论

针对致泻性大肠埃希氏菌的常规分离培养方法主要是指GB/T 4789.6-2003中所用方法，该方法主要分为增菌、分离、生化试验、血清学试验、肠毒素试验五个部分，前后耗时约4 d，该方法的优点是结果准确可靠，可检测出致泻性大肠埃希氏菌的血清型，缺点是所耗时间较长，且操作繁琐，检测结果无法表明致病菌所携带的致病基因[17]。免疫学检测方法存在与非抗原物质之间的非特异性反应，从而会产生假阳性结果，而如果待测抗原被样品中一些物质或其他优势菌群所掩蔽，又会产生假阴性结果。大肠杆菌的抗原很复杂，各种肠道细菌之间可能会发生基因的水平转移，而且还存在抗原表达不完全和抗原间抑制抗原-抗体凝集反应的现象，从而影响了免疫学方法的特异性和敏感性。PCR技术因其特异性强、灵敏度高、操作简便、所需时间短等优点，成为当前最先进、最广泛使用的检测技术。而加染料或探针的荧光实时PCR既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点，可实现实时监控，且不需要普通PCR的后处理，极大地减少了污染的机会，同时也避免了染色剂对人体的毒害作用[9,13]。致泻性大肠埃希氏菌包括很多致病基因，若要实现在同一个反应中将致病基因全部检出的目的，就需要应用多重PCR技术。根据所用荧光物质的不同，荧光实时PCR技术主要分为SYBR GreenⅠ染料法、Taqman探针法和分子信标法。本文所研究的Taqman多重实时PCR技术即可在同一PCR反应管内同时检出3种病原微生物，有效地解决了单基因PCR体系1次只可检测1个基因型的低效缺点，具有高效、快捷、灵敏的特点。

本方法对3种致泻性大肠埃希氏菌的检出限均可达到102cfu·mL-1，但通常致泻性大肠埃希氏菌在原料乳中的数量较小，能达到每毫升几十个甚至几个的数量，由于如果直接从所采集的样品中提取DNA后，进行Taqman三重实时PCR扩增，势必会造成假阴性的结果，所以需要对原料乳进行一定的增菌处理，以提高该方法于实际应用中的可行性。本研究在2 h增菌处理后可达到1 cfu·mL-1，符合致泻性大肠埃希氏菌在原料乳中的实际存在状况，具备实际应用价值。

张伟钦对EPEC和EIEC原始菌体浓度分别为为8.8和6.7 cfu·mL-1的两份乳样进行2 h的增菌处理后，进行双重实时PCR，两种菌均可出现扩增曲线，但Ct值要略高于本试验[7]。Bottero等对模拟乳样过夜增菌后，在多重PCR中加入六对引物检测致泻性大肠埃希氏菌的基因型，对于ETEC的st和lt的检测限分别为 5×104和 5×106cfu·mL-1[8]，由于常规PCR较荧光PCR灵敏度不够，同时多对引物间的竞争作用提高体系的复杂性，从而降低扩增效果，使得检测限较高，但可看出若选择st基因作为ETEC的目的基因，于相同条件下可相对提高检测限。

4 结论

本研究采用已建立了反应体系和循环参数的三重实时PCR方法可快速检测原料乳中致泻性大肠埃希氏菌，达到了一次PCR反应即可检测3种病原菌的目的。试验证实此方法特异性强，重复性良好，CV值均小于5%，对EIEC的检出限可达到2.81×102cfu·mL-1，对 EPEC 的检出限可达到2.15×102cfu·mL-1，对 ETEC的检出限可达到 5.40×102cfu·mL-1，同时当致泻性大肠埃希氏菌菌体浓度达到1 cfu·mL-1时，只需富集培养2 h，即可检出阳性结果，大大提高了灵敏度，完成全部检测过程只需大约6 h，简便快捷，可实时监控反应进程。

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