沼气发酵复合菌系的筛选及培养条件优化

戚桂娜 ，张波 ，王彦杰 ，荆瑞勇 ，高亚梅 ，王伟东

（1.黑龙江八一农垦大学生命科技学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学工程学院）

随着畜禽养殖业的不断发展，规模化畜禽饲养的比例不断扩大，大量的没有处理的畜禽粪尿对环境造成了严重污染，为此，国内外学者就畜禽养殖对环境污染的影响进行了广泛深入的研究[1-6]。采用厌氧消化技术处理畜禽粪便等废弃物，不仅可以减少畜禽粪便对环境造成的污染，同时还产生清洁的生物质能源沼气，为固体废弃物的可再生利用提供了广泛的应用前景。

厌氧发酵生产沼气的过程是由多种微生物相互作用共同来完成的，产甲烷菌群和非产甲烷菌群间通过互营联合生成甲烷[7，8]，因此，沼气发酵微生物的研究一直是该领域研究的热点。对于沼气发酵微生物的研究国内外学者都进行了广泛的研究，孙征等、Simankova等、Ma等以及Kendall等从不同的环境中分别分离得到了若干不同的产甲烷古菌[9-12]。人们逐渐意识到发酵菌种在沼气发酵过程中扮演的重要角色，因此，越来越多的研究者对于厌氧发酵菌种驯化开展了深入的研究，希望通过驯化培养获得高产气效率的沼气发酵微生物系统。张翔等研究了在高温条件以生活污水处理厂的不同种类污泥作为接种物对厌氧发酵各参数的影响，结果表明以驯化后的污泥为接种物，可以加快厌氧启动速度，提高产气量[13]。陆清忠等利用驯化的低温菌群为接种物，加入沼气池内增加池内微生物菌群的数量来提高产期率，结果比对照日平均产气量和总产气量增长率达158.97%和159.03%[14]。众多研究结果表明，在畜禽粪便厌氧发酵初始阶段加入一定量的接种物，对提早产气和提高产气量有重要的作用[15-17]。但是，以往的关于沼气发酵接种物的研究，都是直接把沼液或者通过一定的驯化方式驯化的沼液作为接种物作为研究对象，接种物的微生物组成不清楚，接种物不能稳定遗传，无法作为恒定的研究对象进行机理性研究。如果能够得到遗传稳定、高效产甲烷的复合菌系，既可以解决上述理论研究问题，又可以用于沼气的生产实践。本文就是按照上述思路，在实验室条件下利用限制性培养技术，构建了1组35℃条件下遗传稳定的、产甲烷量高的沼气发酵复合菌系并对其培养条件进行了研究，以期获得该复合菌系最适宜的发酵条件，达到产气速度快、产气量高的目的，为厌氧发酵的生产实践提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验装置

本试验所用的沼气发酵复合菌系装置和集气装置由两部分组成，如图1所示。反应器置于35℃培养箱内恒温控制，选用250 mL培养瓶作为发酵装置，瓶口用适当大小的不透气橡皮塞塞紧，在橡皮塞的中央用点滴管导气连接到一个量筒中，将集气量筒倒扣于盛满水的容器内，采用排水集气法收集气体。

图1 沼气复合菌系培养装置Fig.1 The cultural device of microbial community of biogas production

1.2 试验材料

沼气发酵复合菌系，由本实验室利用限制性培养技术经过多代的培养获得，牛粪，厌氧菌培养基，真空泵，集气量筒等。

1.3 试验方法

1.3.1 沼气发酵复合菌系的构建

将取自黑龙江省大庆市林甸县沼气池中的池液作为供菌种样品，以10%的接种量接种到装有100 mL无氧富集培养基的沼气发酵装置中，密封，用真空泵抽真空后将纯度为99.999%氮气充入培养瓶中，反复抽真空和充入氮气，直至加入指示剂树脂刃天青的发酵培养基变为无色为止，连接集气装置，35℃静置培养。当日产气量呈下降趋势后，取10 mL培养液作为种子接到同样的新鲜培养基中。如此一直继代培养，淘汰产气时间晚、总产气量低的培养物，留下产气时间早、总产气量高的培养物。经几十代以上连续继代培养，选择高效稳定的培养物，进行保存。

1.3.2 发酵液初始pH对沼气复合菌系产气能力的影响

试验设计 5个pH值因素分别为：6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，总固体浓度（TS%）为8%，接种量为10%进行试验，用甲烷产率作为衡量标准。

1.3.3 接种量对沼气复合菌系产气能力的影响

试验设计3个接种量因素分别为：5%、10%和15%，TS%为8%，pH7.0进行试验，用甲烷产率作为衡量标准。

1.3.4 底物浓度(TS%)对沼气复合菌系产气量能力的影响

试验设计4个发酵液浓度因素分别为：6%、8%、10%和12%，接种量为10%，pH7.0进行试验，用甲烷产率作为衡量标准。

1.3.5 培养条件优化组合试验

分别以初始pH、底物浓度（TS%）和接种量为因素进行了单因素试验，根据单因素试验结果，采用正交组合进行试验，研究各因素组合对沼气发酵的影响，用甲烷产率作为衡量标准，因素水平表如表1。因为试验是3因素3水平的试验，选取L9（33）即可满足要求，根据正交表L9（33）安排试验。

表1 因素水平表Table 1 Different level values of the factors

1.4 测定方法

1.4.1 日产气量测定

采用排水集气法。

1.4.2 甲烷含量的测定

测定仪器为岛津GC-17A型气相色谱仪，火焰光度检测器（FID），毛细柱（DB-1）0.53 mm×15 m。柱温：100℃；进样口温度：110℃；检测器温度：200℃；载气流速：20 mL·min-1；氢气压力：50 kpa；空气压力：55 kpa。

2 结果与分析

2.1 沼气发酵复合菌系的获得

按照1.3.1的试验方法，以甲烷产量和产气时间作为衡量指标，连续富集培养。逐渐淘汰产气率低、产气慢的组合，留下产气量高、产气快的组合。经过20代以上的继代培养，复合菌系的产甲烷能力与产甲烷时间逐渐稳定。选取其中一组产气时间早、产气量稳定的沼气复合菌系进行连续5代的富集培养，进行日产气率分析。图2为传代至第22代至26代沼气复合菌系后发酵液的日产气率的变化，从图中可见，日产气率逐渐稳定，最高产气率可达1.6 m3·m-3·d-1。

图2 连续富集培养五代的沼气复合菌系的日产气率的变化Fig.2 Change of daily biogas yield at five different generation of microbial community

2.2 初始pH值对复合菌系产气能力的影响

不同初始pH值对沼气复合菌系沼气发酵的甲烷产率的动态变化见图3。沼气发酵进行到第3 d各处理出现甲烷产率高峰，甲烷产量最高的处理为初始 pH 值为 7.0 的处理，为 0.57 m3·m-3·d-1，其次为初始pH值为6.5的处理。随着培养时间推移，甲烷产率逐渐降低，培养9 d后，各处理甲烷产率趋于平稳。由此表明，初始pH值为6.5～7.5是沼气复合菌系适宜的培养条件。

图3 初始pH值对接种沼气复合菌系甲烷产率的影响Fig.3 The effect of different initial pH of microbial community of biogas production on methane yield

2.3 接种量对复合菌系产气能力的影响

不同接种量接种对沼气复合系甲烷产率动态变化的影响见图4。沼气发酵第9 d，各处理出现甲烷产率高峰，最高处理为15%接种量处理，为0.49 m3·m-3·d-1，其次为接种量为5%的处理。但接种量为10%的处理，甲烷产气高峰出现在第5 d，其甲烷产率为0.45 m3·m-3·d-1。随着培养时间推移，甲烷产率逐渐降低，培养13 d后，各处理甲烷产率趋于平稳。由此表明，与其他处理相比，接种量为10%的处理产甲烷高峰可提前4 d。考虑成本及产气高峰出现时间，本研究采用10%为最适接种量。

图4 接种量对沼气复合菌系甲烷产率的影响Fig.4 The effect of inoculation quantities of microbial community of biogas production on methane yield

2.4 底物浓度（TS%）对复合菌系产气能力的影响

不同底物浓度对沼气复合菌系甲烷产率的动态变化影响如图5。沼气发酵第7 d，各处理出现甲烷产率高峰，最高处理为底物浓度为8%的处理，甲烷产率为 0.56 m3·m-3·d-1，其次为底物浓度为 10%的处理。随着培养时间推移，甲烷产率逐渐降低，培养20 d后，各处理甲烷产率趋于平稳。由此表明，固形物含量为8%的处理在产甲烷高峰时，可提高甲烷产率。

图5 底物浓度对沼气复合菌系甲烷产率的影响Fig.5 The effect of substrate concentrations of microbial community of biogas production on methane yield

2.5 正交组合试验结果分析

以初始pH、底物浓度（TS%）和接种量为试验因素，产气量和产甲烷产量为测定指标设计的正交试验安排及结果见表2。在9组试验中产气量最高的为第 9 组，产气量可达到 0.52 m3·m-3·d-1，甲烷含量达到 0.40 m3·m-3·d-1。其次是第 3 组试验，最高产气量为 0.48 m3·m-3·d-1，甲烷含量为 0.34 m3·m-3·d-1。通过SPSS软件对试验结果进行了方差分析结果见表3。

表2 正交试验方案及试验结果表Table 2 Orthogonal test analysis and results of the experiments

表3 方差分析结果Table 3 The results of variance analysis

由表3的方差分析结果可知，试验各因素均未达到显著水平，可能是由于所选因素不够全面，在此梯度范围内差异不够明显。但是，从产气量和甲烷含量分析可知：B因素（底物浓度）F值最大，其次是因素A（接种量），影响最小的为C因素（pH）。说明，在整个发酵过程中发酵液底物的总固体浓度在发酵过程中对产气量的影响最大，接种量对发酵的影响不大，接入接种物一般是为了加大发酵体系的微生物量，加快发酵启动的时间和缩短发酵周期的目的。C因素在整个发酵过程中的影响不显著且作用最小，说明整个发酵系统对pH的缓冲能力比较强，在较宽泛的范围内都能进行正常的沼气发酵。

所以，通过本实验可以得出在后续的发酵过程中为了尽量提高底物浓度，一般选取5%为接种量，10%的底物浓度，pH一般自然状态就可以。这样不但可以增加产量，同时也可以提高甲烷的含量。

3 讨论与结论

随着对禽畜粪便厌氧发酵中微生物菌群功能的逐渐认识，人们逐渐意识到了纯培养的局限性，一些研究者已经开始利用各种方法研究利用多次驯化培养的培养物为接种物来进行沼气发酵的实验[18-20]，但是在人工可控条件下具有遗传稳定和产气能力稳定的产甲烷复合菌系还未见报道。本实验构建的中温35℃条件下产气和遗传稳定的沼气发酵复合菌系，产气率与其他研究报道相比相对低[21-23]，分析其原因可能如下：首先，整个发酵过程没有进行搅拌，同时是分批试验，不是连续进出料试验，造成产气率较低。其次，发酵原料为牛粪，牛粪本身的产气率较低。第三，发酵容器体积小，可能影响产气率。针对以上分析，今后试验将进行相应的改进。

本试验以牛粪为发酵基质，在设计的三个单因素试验中，pH6.0～8.0中以初始pH值为7.0的处理与其他组相比效果最好，这和Herbert、刘德江等的试验pH值在6～8范围内均可发酵、但是pH调到7.5左右发酵最佳的报道相符[24，25]。接种量的试验中接种量为10%的处理产甲烷高峰可提前4 d，与15%接种量相比提前达到产甲烷的高峰期，综合考虑成本及产气高峰出现时间等因素，10%可作为适宜的接种量。在底物浓度的实验中，底物浓度为8%时甲烷含量最高。在夏季气温较高条件下，当底物浓度达到10%、12%时，发酵液浓度过高造成了发酵液的pH变化过大，进而影响了微生物的生长，所以产甲烷量就受到了明显的影响，这与夏国俊的研究，沼气池在夏季最佳物料浓度为6%～10%相符[26]。这说明采用不同的发酵工艺形式，发酵料液的浓度对产气效果的影响是不同的。通过单因素和L9（33）正交实验分析，根据实际情况进行修正后确定该沼气复合菌系的最佳发酵条件为：接种量5%，底物浓度10%，pH自然状态，培养温度35℃。

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