黄曲霉毒素直接竞争法ELISA试剂盒的研制及其在花生和花生制品中的应用

北京中检维康技术有限公司 王 雄 王艳斐 果 旗 荣 钊 陈冰君

长江大学生命科学学院 王 丽

中国原子能科学研究院 吴继宗

目前，黄曲霉毒素（AFT）的检测方法主要有薄层层析法、色谱法和微管柱筛选法等 （张艺兵等，2006）。这些方法因精确度低、敏感性差；样品前处理过程复杂费时；或需要价格昂贵的仪器，检测成本高，难以推广应用，影响了饲料中黄曲霉毒素的有效监测。酶联免疫吸附法（ELISA）是在免疫学和细胞工程学基础上发展的一种微量检测技术，特别适合对黄曲霉毒素污染监控中大量样本的筛检（路戈和计融，1996）。本研究以B细胞杂交瘤技术，以能分泌抗黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株为基础，建立了一种高效、准确、简便、适用于大批量样品筛选的定性、定量的用于检测饲料中黄曲霉毒素的ELISA检测方法。

1 基本原理

酶联免疫法是以抗体和抗原的特异性结合为基础的，以酶或者辅酶作为标记物，标记抗原，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。本实验最大的特点就是利用聚苯乙烯微量反应板，吸附抗抗体，使之固相化，加样品提取液和酶标AFT抗原 （AFT与辣根过氧化物酶的结合物），在酶标板内进行酶促反应。加底物（TMB）显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标抗原的结合量。样品中黄曲霉毒素多，则被抗体结合的酶标抗原就少。在辣根过氧化物酶存在下，底物与其反应，显蓝色，硫酸终止后显黄色。用酶标仪读数，用专用软件分析，即可得出黄曲霉毒素的含量。

2 材料与方法

2.1 仪器和试剂

2.1.1 主要仪器 酶标分析仪 （Thermo Labsystems），高速离心机（北京时代北利离心机有限公司），电子分析天平（Mettler Toledo），电热恒温培养箱 （天津市中环实验电炉有限公司）；CO2培养箱（Thermo公司）；洁净台（天津科学仪器厂）；生物倒置显微镜（日本欧林巴斯光学株式会社）等。

2.1.2 试剂 抗黄曲霉毒素B1杂交瘤细胞株（北京中检维康技术有限公司研制）；HRP标记黄曲霉毒素（北京中检维康技术有限公司研制）；黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、T-2毒素、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、牛血清白蛋白（BSA）、伏马菌素B1等（均购自Sigma公司）。

2.2 单克隆抗体制备 将抗黄曲霉毒素B1杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔，获得含抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的腹水，并将所得腹水采用饱和硫酸铵盐析法进行纯化（路戈和计融，1996）。

2.3 抗体特性鉴定

2.3.1 单克隆抗体效价的测定 应用间接ELISA法测定纯化后的单克隆抗体的效价。判定标准：以腹水OD值除以SP2/0腹水OD值大于或等于2的最高稀释倍数为腹水效价。

2.3.2 单克隆抗体特异性的测定 选择呕吐毒素、赭曲霉毒素A、伏马菌素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、牛血清白蛋白（BSA），将不同浓度上述毒素替代黄曲霉毒素标准品溶液，应用直接ELISA法测定其标准曲线，计算出50%抑制浓度（IC50），并计算交叉反应率。计算公式如下：

2.4 试剂盒各项技术参数研究

2.4.1 抗抗体与单抗、酶标抗原最适工作浓度的确定 采用方阵法确定抗抗体、单抗及酶标抗原的最适工作浓度，每板同时设阴性对照。判断标准：选择OD值在1.5左右时，包被抗抗体浓度、单抗以及酶标抗原浓度为最适工作浓度。

2.4.2 标准曲线的建立 采用直接竞争ELISA方法建立标准曲线，选择合适的标准品浓度，以无黄曲霉毒素抑制时的OD值为B0值相应浓度黄曲霉毒素抑制时的OD值为B值，百分吸光度值（B/B0）为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.5 实验方法

2.5.1 样品前处理

2.5.1.1 称取5 g样品，加入25 mL样品提取液（70%甲醇水），剧烈振荡3 min（用手或振荡器）。2.5.1.2 将提取液用普通滤纸过滤，取3 mL稀释液加入3 mL正己烷，振荡1 min，3000 r/min离心2 min去上层，取下层以稀释缓冲液按1∶1的比例稀释（吸取 500 μL 滤液，加入 500 μL 稀释液缓冲液），该液为待测液。样本稀释倍数为10倍。

2.5.2 测定步骤

2.5.2.1 酶标板的制备：以pH 7.2的磷酸钠盐缓冲溶液作为包被缓冲液，将抗体稀释到最佳工作浓度，每孔加入200 μL，37℃温育2 h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入200～250 μL 0.7%的明胶封闭液，37℃温育1～2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝箔袋真空密封保存。

2.5.2.2 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架，标准品和样品做2个平行实验，记录下标准品和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋封好置2～8℃冷藏保存。

2.5.2.3 分别将标准品和样品加至相应的微孔（双孔）中，然后再各加入稀释后的酶标抗原，最后加入稀释后的抗体，加盖，在37℃温育10 min（每个标准和样品必须使用新的吸头）。

2.5.2.4 倒出孔中的液体，然后每孔加入洗涤液洗涤，重复操作4次，洗完后用力在吸水纸上拍干。

2.5.2.5 加入显色液，37℃避光温育15 min。

2.5.2.6 加入硫酸终止液，终止反应。

2.5.3 结果判定 结果的判定方法：所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

以黄曲霉标准品浓度值（μg/kg）为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

样品的实际浓度为读数结果乘以稀释倍数。

2.5.4 回收率实验 根据试剂盒的检测范围确定加标浓度，在不含黄曲霉毒素的三样品中分别进行 5、10、20 μg/kg 三个浓度的加标回收实验，每个加标水平做4个重复的平行样。样品按照2.5.1提取方法进行提取，待测液用ELISA进行检测。

2.6 试剂盒稳定性实验 对试剂盒稳定性采用37℃加速破坏实验进行研究，将试剂盒分别放置于4℃和37℃，每隔24 h进行ELISA测定，测定阴性对照（不加毒素B0）和阳性（即50%的抑制毒素浓度B）的吸光度（A）值，计算两者的比值（B/B0）。 当 B0<0.6 个吸光度（A）值，或 B/B0<0.7A时，即可判定ELISA试剂盒已失效。在37℃放置24 h相当于在4℃放置45 d。从试剂盒的生产日期到失效日期的时间可确定为ELISA试剂盒的稳定周期，即保质期。

3 结果分析

3.1 单克隆抗体特性鉴定 杂交瘤细胞株产生的腹水抗体经纯化后，抗体效价约为1∶30000，抗体的工作浓度为1∶20000。抗体与T-2毒素、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1等其他真菌毒素和牛血清白蛋白的交叉反应均小于0.1%。

3.2 试剂盒技术参数 根据方阵法确定，抗体的最适工作浓度为1∶20000，黄曲霉羊抗鼠抗体的最适包被浓度为 1∶5000，酶标抗体浓度为 1∶7000。标准曲线中黄曲霉毒素的浓度分别为 0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL， 最低检出浓度是 0.5 ng/mL，标准曲线方程为y=-7.5x+88.6，R=0.995，线性范围为0.5～10.0 ng/mL，50%的抑制浓度为1.5 ng/mL左右。

3.3 回收率测定 对花生及制品做黄曲霉毒素的回收率实验，加标浓度分别为 5、10、20 μg/kg。其加标回收率的范围为70%～110%，具体见表1。

表1 花生样品中回收率实验结果

3.4 试剂盒稳定性试验 经37℃稳定实验，试剂盒能在37℃下存放150 h后，阴性对照吸光度值为0.75，仍然大于0.6。所以该试剂盒有效期能达到6个月。

4 讨论

因为ELISA是利用抗体的选择性和标记酶的化学放大的灵敏性建立起来的，故应考虑的因素主要有以下几方面（Richard 等，1994）：（1）抗体包被：将抗抗体固定在聚苯乙烯微量反应板中称为包被，包被的质量是影响抗原、抗体反应的重要因素。（2）非特异性反应：ELISA中会发生许多非特异性反应，严重干扰分析结果，选择适合的抗原、抗体组合，可以明显的减少这种反应的发生。（3）酶和抗原的偶联：酶和抗原偶联的好坏，直接影响试剂灵敏度。本实验操作时采用的是辣根过氧化物酶与抗原偶联CMO的方法。（4）底物：当酶标记抗原-抗体复合物与底物相遇时，复合物中的酶水解底物，是无色的底物溶液生成有色的反应产物。因此，应注意底物溶液的避光性。（5）洗涤：酶促反应，每次反应后都需反复洗涤，这既保证了反应定量关系，也除去了血清中与反应无关的其他成分及游离的复合物等。洗涤效果与检测结果密切相关。如果洗涤不充分，常引起结果的紊乱，最好做到洗涤的步骤标准化。

5 小结

本研究在制备出针对黄曲霉毒素有较好的灵敏度，在特异性抗体和酶标抗原基础上，研制出对饲料中黄曲霉毒素的ELISA快速检测试剂盒。该试剂盒最低检出浓度为0.5 μg/kg，对样品的检测范围为5.0～100 μg/kg，试剂盒所用单克隆抗体与其他真菌毒素均无交叉反应，具有较高的特异性。对花生及花生粕做添加回收率实验结果为70%～110%，重复性和再现性良好，在2～8℃条件下可以保存6个月。以上技术参数均达到试剂盒的技术要求，而且具有简单、快速、灵敏、准确、特异性好，并可同时检测大量样品等优点，值得推广应用。

[1]路戈，计融.食品中黄曲霉毒素B1单克隆抗体酶联免疫测定方法的建立及初步应用[J].卫生研究，1996，5（3）：162 ～ 165.

[2]张艺兵，鲍蕾，禇庆华，等.农产品中真菌毒素的检测分析[M].北京：化学工业出版社，2006.1～6.

[3]Richard J Cole，Joe W.Dorner.Extraction of aflatoxin from Naturally contaminated peanuts and solvent peanut rations[J].J AOAC，1994，77（6）：1509 ～1511.