正交设计法优选骨刺宁膏乙醇渗漉提取工艺

（佛山市中医院制剂中心，广东佛山528000）

正交设计法优选骨刺宁膏乙醇渗漉提取工艺

霍燕娴

（佛山市中医院制剂中心，广东佛山528000）

目的优选骨刺宁膏的乙醇渗漉提取工艺条件。方法以丹皮酚的提取量为考察指标，用高效液相色谱法测定丹皮酚含量，以乙醇浓度、乙醇用量、浸泡时间、渗漉速度为考察因素，选用L9（34）正交表进行试验。结果最佳提取工艺为：药材加10倍量的90%（w）的乙醇浸泡36 h，以2 mL／（min／kg）速度渗漉提取。结论该提取工艺所得丹皮酚含量较高，而干膏率较低，且简便易行，稳定性好。

骨刺宁膏；正交设计；提取工艺；丹皮酚；高效液相色谱法

骨刺宁膏是由徐长卿、川芎、当归、威灵仙、红花等11味中药组成，具有祛风通络，活血止痛的功效。经多年临床验证，对颈椎、腰椎、四肢关节骨质增生引起的酸胀、麻木、疼痛等症有很好的疗效。原临床使用是将药材粉碎为细粉制成散剂，用蜂蜜或水调匀成糊状敷贴患处。为了提高疗效和方便使用，现将其改革为橡胶贴膏剂型。进行工艺研究过程中，考虑到有效成分的最大提取和减少杂质提取量，采用了乙醇渗漉提取方法。对渗漉提取工艺进行了L9（34）正交试验，以乙醇浓度、乙醇用量、浸泡时间、渗漉速度为影响因素，以徐长卿中有效成分丹皮酚提取量为考察指标，采用高效液相色谱法测定丹皮酚含量，试验结果报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent1100高效液相色谱仪（G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1314A可变波长紫外检测器，G1379A真空脱气泵，G1316A柱温箱，G2170A色谱工作站）；METTLE AE 240电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；BUG25-06超声波发生器（功率250 W，频率25 kHz；上海必能信超声仪器有限公司）。

1.2 试药丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110708-200505）；徐长卿对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：121514-200501）；其它药材均购于佛山市医药集团有限公司；乙腈为色谱纯；水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 渗漉提取工艺设计采用L9（34）正交试验，设置乙醇浓度、乙醇用量、浸泡时间、渗漉速度4个因素，每个因素进行三水平考察，以徐长卿中有效成分丹皮酚提取量及干膏收率为评价指标，见表1。

表1 因素水平表

2.2 色谱条件色谱柱为Hypersil ODS2 C18（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-水（45∶55）；［1］流速为1.0 mL／min；检测波长为274 nm；柱温为30℃；进样量为10μL。

2.3 对照品溶液的制备精密称取丹皮酚对照品1.8 mg，用甲醇溶解并稀释成0.18 mg／mL的溶液，作为对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备按处方比例精密称取各药材粗粉共约50 g，其中徐长卿药材约6 g，共9份，分别按表1正交设计方案提取，根据不同提取量各吸取适量，挥干溶剂后用甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，即得。

2.5 阴性样品溶液的制备按比例称取不含徐长卿的其余药材用70%乙醇渗漉提取，按供试品溶液制法制备，即得。

2.6 干扰试验分别吸取丹皮酚对照品溶液、5号供试品溶液、缺徐长卿的阴性样品溶液各10μL按上述色谱条件进样，检测，可见丹皮酚对照品、供试品在14 min左右出现丹皮酚特征吸收峰，且与其它组分峰分离较完全，徐长卿阴性对照溶液无干扰。

2.7 线性关系考察分别精密吸取丹皮酚对照品溶液4，8，12，16，20，24μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，记录色谱图并以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积值（mv／s）为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程：Y＝23 980.76X＋1 446.82（r＝0.999 7）。结果表明，丹皮酚在0.72～4.32μg范围内线性关系良好。

2.8 回收率试验精密量取3号样品渗漉液10 mL，共6份，分为3组，分别加入丹皮酚对照品溶液适量，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容于10 mL量瓶中，即得加样回收供试液，取10μL进样，按上述方法检测，计算回收率为98.06%，RSD为1.25%。

2.9 重复性试验精密量取3号样品渗漉液，共5份，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下测定，结果丹皮酚平均含量为1.62%，RSD为1.6%。2.10稳定性试验吸取同一供试品溶液10μL，分别于0，4，8，12，24 h进样，按丹皮酚峰面积计算，RSD为0.82%，表明供试品在24 h内基本稳定。

2.11 正交试验结果将1～9号样品渗漉液各取一半，水浴浓缩，并减压干燥成干浸膏，称重，计算干膏得率；精密吸取1～9号供试品溶液各10μL，进样测定，计算丹皮酚含量，正交试验结果见表2，方差分析见表3，4。

表2 正交设计方案和试验结果

表3 丹皮酚含量方差分析

表4 干膏得率方差分析

从表2直观分析，影响丹皮酚提取量和干膏得率的因素的大小顺序分别为：A＞C＞D＞B，A＞B＞C＞D。表3，表4方差分析表明：乙醇浓度对丹皮酚提取量和干膏得率均有显著性影响，此外，浸泡时间对丹皮酚提取量也有显著性影响；而乙醇用量对干膏得率也有显著性影响，表明：乙醇含水量高，使用量大，所提取的浸膏量也多。综合考虑，确定优选工艺为A3B1C3D1，即用10倍量的90%（w）的乙醇浸泡36 h，以2 mL（min／kg）速度渗漉提取，此工艺提取的丹皮酚含量高，而浸膏得率低，适合贴膏剂的制备。重复性试验与此一致。

2.12 验证试验按处方比例称取徐长卿等药材50 g，共3份，用优选工艺提取，分别称定，计算干膏得率，测定丹皮酚含量。3批药材所测干膏率分别为9.26%，9.17%，9.33%，丹皮酚提取量分别为1.52%，1.54%，1.51%。测定所用药材徐长卿中丹皮酚含量为1.56%，符合《中国药典》2005年版一部中徐长卿药材中按干品计算，含丹皮酚不得少于1.3%的规定［2］。经计算，优选提取工艺所得丹皮酚的平均转移率达97.6%。

3 讨论

3.1 外用散剂由于使用不便，患者操作麻烦，且有效成分从药材细胞中释放率低，皮肤吸收相对较慢，故改为贴膏剂型，使用方便，疗效显著提高。并通过正交试验比较了徐长卿的乙醇渗漉工艺、回流工艺和水蒸气蒸馏提取工艺，结果表明渗漉法最优。

3.2 丹皮酚测定试验中曾比较甲醇-水、乙腈-水二种流动相，以乙腈-水为流动相所得色谱峰形好、分离效果较优，并试验过流动相乙腈-水不同配比（70∶30）、（65∶35）、（60∶40）、（55∶45）、（50∶50）、（45∶55）、（40∶60）进行实验，结果以本文选择的流动相乙腈-水（45∶55）的分离效果最好。

［1］湛文青，李华.HPLC法测定徐长卿中丹皮酚的含量［J］.中药材，2004，27（2）：104.

［2］国家药典委员会.中国药典一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：200.

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1007－4813（2010）04－0593－02

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