雷公藤多苷致体外幼鼠睾丸生精细胞凋亡的初步研究

刘立新,张羽男,张楠楠,袁 寰

(佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

近年来,雄性动物生殖机能减退现象逐渐受到人们的重视,出现了诸如性欲减退、精液品质下降、受精能力降低的现象,人类更是受到了“ED(勃起功能障碍)”的困扰。当然,生殖功能下降是由多方面原因引起的,但药物是其主要因素之一。雷公藤多苷是从植物雷公藤根提取精制而成的一种脂溶性成分混合物,是目前临床上使用较多的中成药制剂,其临床应用范围广泛,几乎涉及内科、外科、皮肤科、眼科、儿科等广泛生命科学领域。但随着雷公藤多苷应用范围的扩大,其毒副作用也越来越受到人们关注,尤其在生殖毒性方面。动物实验表明,雷公藤多苷可使雄性大鼠产生可逆性不育,有关雷公藤多苷生殖损害方面的报道多见集中在体内的研究,且仅限于成年鼠,而对于体外和有关幼鼠的研究鲜有报道,本试验以体外培养的幼鼠睾丸生精细胞为研究对象,从细胞水平探讨雷公藤多苷对幼鼠生殖细胞的毒性,为进一步揭示雷公藤多苷生殖毒性机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料

动物:15d龄 SD雄性大鼠,购自哈药集团制药总厂实验动物中心。药品:雷公藤多苷片(江苏美通制药有限公司);四噻唑蓝(M TT)(Amresco产品);其他化学试剂均为分析纯试剂。

1.2 主要仪器

二氧化碳培养箱(HPP-9162北京东联哈尔仪器制造有限公司);970CRT荧光分光光度计(上海棱光精密科学仪器有限公司);318型酶标监测仪(上海科学仪器三厂)。

1.3 方法

1.3.1 幼鼠睾丸生精细胞悬液的制备

参照文献方法[1]略有改进,取15d雄性幼鼠,颈椎脱臼法处死。无菌收集两侧睾丸用无菌 PBS(0.01M,pH7.3)洗涤,去包膜,将生精小管剪为约3～ 4mm小段,加入0.01M PBS 2mL,吹打成悬液,300目筛网过滤,1000r/min,离心 5min,弃上清液;沉淀物加入 2mL0.01M PBS清洗,吹打均匀后,以1000r/min,离心 5min,弃上清液;如此重复清洗 2次;用 2mL 70%冰乙醇将细胞沉淀吹打、制成悬液,备用。

1.3.2 MTT比色法

将分离的细胞接种于96孔培养板,待细胞长满单层后,弃去培养液,加入含雷公藤多苷的培养液,使雷公藤多苷的终 浓度 分 别为 2.5μ g/L、 5μ g/L、 10 μg/L、20 μg/L、 40μ g/L同时设立不加雷公藤多苷的对照组和无细胞对照组,培养24h后,每孔加入 M TT溶液使其终浓度为0.5mg/mL。37℃恒温孵育4h,吸去上清,每孔加入200 μL酸化异丙醇,震荡 10min,使结晶物充分溶解,取100 μL溶液并转移到一个新的96孔培养板,用酶标仪在570nm波长测定吸光值,记录结果,计算细胞的存活率,并计算 IC50。

1.3.3 幼鼠睾丸生精细胞凋亡的检测

1.3.3.1 吖啶橙荧光染色法[2]

细胞培养长成单层后,加入含雷公藤多苷的培养液,使雷 公 藤 多 苷 的 终 浓 度 分 别 为 2.5μ g/L、 5μ g/L、 10μg/L、20 μg/L,同时设对照组,培养箱中培养24h,按1.3.3方法收集细胞,调整细胞密度为 1× 106/mL,取95μL细胞悬液加入5μL吖啶橙荧光染色液(100 μg/mL,pH6.0),混匀后,将细胞悬液滴加到载玻片上,于荧光显微镜下观察计数,每个样品计数100个细胞,根据以下公式计算细胞凋亡指数和细胞坏死指数。

凋亡指数=凋亡细胞数÷(正常活细胞数+凋亡细胞数+坏死细胞数)×100%

1.3.3.2 TUNEL法

按试剂盒使用说明进行测定。

1.4 统计学处理

试验数据采用 SPSS及 Excel软件进行分析,所有值均以± s表示。

2 结果

2.1 M TT法检测细胞活性

采用 MTT法对不同浓度雷公藤多苷作用的幼鼠生精细胞进行细胞活性检测,结果见表1和图1。由表1和图1可见,随着雷公藤多苷浓度的增加,细胞的相对存活率下降,而且浓度越大细胞的存活率越低,具有一定的剂量-效应关系,这表明雷公藤多苷对幼鼠生精细胞具有一定的毒性作用,能抑制细胞的活性,其 IC50为23.32±3.26。

表1 雷公藤多苷对鼠睾丸生精细胞活率影响的结果±s)

表1 雷公藤多苷对鼠睾丸生精细胞活率影响的结果±s)

图1 MTT法测定雷公藤多苷对幼鼠生精细胞相对存活率的影响

2.2 雷公藤多苷致幼鼠生精细胞凋亡检测

吖啶橙染色法:不同浓度雷公藤多苷作用的幼鼠生精细胞经吖啶橙染色后,显微镜下观察,正常细胞核呈黄绿色均匀荧光。凋亡细胞呈黄绿色浓集在核膜内侧,可见凋亡小体。由表2和图2可以看出,随着雷公藤多苷浓度的增加,凋亡指数逐渐增大,加雷公藤多苷药物组与对照组比较差异均极显著(P＜0.01)。

表2 雷公藤多苷对鼠睾丸生精细胞吖啶橙荧光染色的结果 ±s)

表2 雷公藤多苷对鼠睾丸生精细胞吖啶橙荧光染色的结果 ±s)

图2 雷公藤多苷对幼鼠生精细胞凋亡指数的影响

TUN EL法:雷公藤多苷作用的细胞经染色后,显微镜下观察,凋亡细胞的细胞核中有棕色颗粒,非凋亡细胞用苏木素复染为蓝紫色核。随着雷公藤多苷浓度的增加,幼鼠生精细胞凋亡指数逐渐增加,加雷公藤多苷药物组与对照组间比较差异均极显著 (P＜0.01),见表2和图2。

3 讨论

雷公藤多苷是雷公藤根芯的提取物[3],具有广泛的药理作用,从治疗风湿性疾病到系统性红斑狼疮、银屑病、肾小球疾病、肿瘤,到应用于甲状腺疾病、妇科疾病、哮喘等疾病,新近临床上又应用于器官移植如肾移植取得了重大进展[4],但长期大量应用会对生殖系统产生损害作用,而导致不孕。卢清显等[5]给大鼠每日喂服雷公藤总苷10mg/kg17周、13周和20mg/kg14周、10周,结果发现大鼠精子发生及曲细精管晚期精子细胞碱性核蛋白的替代和转换均受到明显抑制。张彬[6]等给 Wistar雄性大鼠每日灌服雷公藤多苷(10mg/kg)8周后,睾丸内的精子细胞及精子减少,曲细精管管腔缘出现病理形态的细胞及多核巨细胞。本试验应用 MTT比色法测定了雷公藤多苷对幼鼠睾丸生精细胞活率的影响,又通过吖啶橙染色法和 TUNEL法测定了雷公藤多苷对幼鼠睾丸生精细胞凋亡情况的影响,结果表明,随着雷公藤多苷浓度的增加,细胞活性逐渐降低,细胞凋亡指数逐渐升高,并呈剂量-效应关系,揭示了雷公藤多苷对幼鼠睾丸生精细胞具有明显的毒性作用。

[1] 杨瑞.刚地弓形虫致小鼠肇丸生精细胞损伤机制的探讨 [D].山西医科大学,2007,9

[2] 王心如.毒理学实验方法与技术 [M].第4版.北京:人民卫生出版社,2007,141

[3] 周嘉陵,朱琦,杨晓凌,等.雷公藤制剂副作用的临床观察 [J].中国中西医结合杂志,1999,19(2):77-79

[4] 黄真,毛庆秋.雷公藤多苷的临床应用、不良反应及预防[J].药品评价,2005,2(2):125

[5] 卢清显,沈晓明,程凯,等.雷公藤总甙对大鼠生精作用及主要脏器的影响 [J].国科学院学报,1990,12(3):203-206

[6] 张彬.雷公藤多苷(GTW)抗雄性生育活动的研究 [J].中国现代医学杂志,2002,12(4):16-17