灵芝孢子粉对无镁活化海马神经元 NGF的影响

赵春霞,王淑秋,丛 岭

(佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)

神经生长因子 (nerve growth factor,NGF)是一类最早研究的能够促进神经元正常生存、生长、分化、维持神经系统正常功能,加快神经系统损伤后修复的神经营养因子之一。目前 N GF对癫痫的作用是倍受争议的。有报道癫痫发作可诱导癫痫动物脑内 N GF升高 ,究竟这种痫性发作诱导 NGF表达水平迅速而短暂地提高,是作为一种内源性的保护,对神经元起到保护,防止凋亡;还是参与了异常轴突生长和突触的重建,从而成为癫痫反复发作的病理学基础,还处在探索之中。

1 材料和方法

1.1 材料

细胞:海马神经元取源于24h以内的新生 Wistar大鼠,购自于佳木斯大学动物实验中心。RIPA细胞裂解液:武汉博士德公司。蛋白酶抑制剂 PM SF:碧云天生物技术公司。AP标记的山羊抗兔 IgG抗体:北京中杉金桥生物技术有限公司。兔抗大鼠β-actin抗体:北京博奥森生物技术有限公司。BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒:碧云天生物技术。兔抗大鼠 N GF多克隆抗体:武汉博士德公司。

1.2 实验方法

Wstern-blot观察 BDNF和 NGF的表达海马神经元用含5%的特级胎牛血清和2%的 B-27的 Neurobasal培养液培养于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。在24孔板内培养至第9天时 ,随机选取培养的细胞进行分组:正常对照组:将维持培养液全液换成正常细胞外液处理3h,爬片;模型组:将维持培养液全液换成无镁细胞外液处理3h,并且在0min,30min,2h,6h,12h等5个时间点上爬片;灵芝孢子粉组:将维持培养液全液换成无镁细胞外液的同时,加入0.125g/mL的灵芝孢子粉处理3h,同样在0min,30min,2h,6h,12h等五个时间点上爬片。

1.2.1 蛋白样品的制备

向收集到的细胞中加入裂解缓冲液(1mL RIPA+10μL PMSF蛋白酶抑制剂),混匀,裂解5min。再离心12000rpm3～5min,吸取上清测蛋白含量。

1.2.2 SDS-PAGE电泳

配制10%分离胶和4%积层胶。电泳:电泳时间一般4～5h,电压为 50V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。

1.2.3 免疫反应

(1)将膜用 TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭 1h。(2)将一抗用 TBST稀释至适当浓度 (在1.5mL离心管中 );室温下孵育 1～ 2h后,用 TBST在室温下脱色摇床上洗10min×2,再用 TBS洗一次,10min。(3)同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1～ 2h后,用 TBST在室温下脱色摇床上洗 10min×2;再用 TBS洗 10min。

1.2.4 显色

加入适量 BCIP/NBT染色工作液,室温避光孵育30min或更长时间(可长达24h),直至显色至预期深浅。去除 BCIP/NBT染色工作液,用蒸馏水洗涤1～ 2次即可终止显色反应。

1.2.5 结果判定

使用上海天能凝胶成像处理系统,计算净光密度值,以Beta-actin为基值,与其进行比较的结果作为其相对的蛋白表达量,然后进行统计分析。

1.3 统计学处理

2 实验结果

正常对照组中只取了相当于0min时的标本,结果可以看见 NGF较弱的表达(见表1,图 1)。在模型组中 ,0min时,可见 NGF的表达强度较正常对照组比较明显增强。在30 min时,NGF的表达强度都达到了高峰,从 2 h开始,两者的表达强度开始减弱,直至24h时,仍可以观察到两者的表达。在灵芝孢子粉组中,各时间点的 NGF表达被完全抑制,但是仍有 NGF的表达,只是强度较模型组中相应时间点明显减弱,并且,各时间点的表达强度相近。

图1 各组细胞的 NGF和β-actin在每个时间点的表达

表1 不同处理组中 NGF相对蛋白表达量 ±s)

表1 不同处理组中 NGF相对蛋白表达量 ±s)

注:模型组与灵芝孢子粉组相比较:P＜0.05。

3 讨论

3.1 N GF及其受体

NGF在神经元的发育、轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用,突出的是 NGF对轴突的生长方向具有决定性的诱导作用。NGF的受体蛋白有两种:一种是高亲和性 N GF受体,在结合的动力上是慢的,是由原癌基因 trk编码的一种酪氨酸蛋白激酶受体,称 TrkA,NGF和TrkA结合可出现细胞学反应,包括增强细胞的存活和生长[1];另一种 NGF的受体蛋白是低亲和性 N GF受体,简称P75.NGF的生物学作用是通过受体介导的,推测其机制可能为 NGF与 TrkA结合后产生信号传递,最终提高自由基清除剂活性;稳定细胞内 Na+/K+浓度比、改变 EAAs受体NMDA对 EAAs的反应性,缓解 EAAs的毒性;影响钙通道和钙排出系统的表达与活化,使细胞内 Ca2+浓度保持稳定[2],因而拮抗癫痫发作所致的细胞凋亡。

3.2 NGF与癫痫

频繁而持续的癫病发作可引起脑内各种酶、神经递质、氨基酸等化学物质迅速变化,可导致脑水肿,甚至脑神经细胞死亡,包括神经元死亡和凋亡两种形式;而凋亡由于是迟发、持续存在和渐进发展的主动性过程,在癫痫神经损害中占重要作用。目前主要认为癫痫产生过程中兴奋性氨基酸增加所致的神经毒性作用和神经元钙离子大量内流所致钙超载是神经元损伤或死亡的直接原因。张强等人[3]通过采用神经节苷脂(GM I)干预致痈大鼠发海马及额叶发现 NGF阳性表达明显高于未干预组,电镜结果显示 GM I干预后癫痫鼠神经细胞损伤明显减轻,并得出 GM I对机体的保护作用可能通过诱导 NGF表达增多来实现的结论。NGF减少神经细胞损伤并参与神经元再生的确切机理可能与拮抗兴奋性氨基酸毒性、稳定细胞内钙离子浓度;增强抗氧化酶、减轻自由基损伤、抗细1胞凋亡、增强蛋白激酶 (protein kinase CPKC)活性有关[4];NGF可通过 NGF高亲和力受体(HNGFR一TrkA)和低亲和力受体(LN GFR一 p75)介导而提高自由基清除剂的活性、稳定细胞内 Na+/K+浓度比、降低兴奋性氨基酸毒性、诱导钙结合蛋白表达、影响钙通道和钙排出系统表达与活化使细胞内 Ca2+浓度保持稳定,从而使受损的神经细胞减轻损伤[5,6]。

本试验结果显示 ,癫痫模型组 NGF自我保护性升高,本结果与文献报道一致。灵芝孢子粉干预后,NGF的含量同模型组中相应时间点的表达量相比较都明显减弱,明显低于癫痫模型组,说明灵芝孢子粉有明显抗癫痫作用。灵芝孢子粉能稳定细胞内的 Na+/K+浓度,促进神经细胞的存活,维持脑内微环境稳态而发挥抗癫痫作用,减轻因癫痫发作引起的神经元损伤。从而有效抑制 N GF的表达升高,抑制海马神经元细胞的凋亡和苔藓纤维发芽的形成,从而有效地延缓癫痫的点燃痫后海马神经元的损伤及痫后发作的强度。灵芝孢子粉的干预机制有待进一步研究。

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