5-氟尿嘧啶固体脂质纳米粒对S180腹水瘤小鼠的抑瘤作用*

梁春丽，沈国鹏#，王舒雨，杜 斌

1)郑州大学化工与能源学院制药工程系郑州450001 2)郑州大学药学院郑州450001

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是常用的化疗药物，由于其半衰期短，不良反应较多，腹腔内局部给药后不能在腹腔内保持长时间的有效浓度，从而影响腹腔内的化疗效果。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是20世纪90年代初发展起来的新一代亚微粒给药系统，以毒性低、生物相容性好、生物可降解的固态天然或合成的类脂为载体，将药物吸附或包裹于脂质膜内，具有可以控制药物释放、避免药物的降解或泄漏以及良好的靶向性等优点［1］。作者以S180腹水瘤小鼠为模型，观察5-氟尿嘧啶固体脂质纳米粒(5-FU-SLN)对腹水瘤模型小鼠腹腔内化疗的效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 JJ500型精密电子天平(美国双杰兄弟有限公司)，电子数显游标卡尺(北京北瑞科信仪器有限公司)，手术器械(张家港市双鹿医疗器械有限公司)，TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)，XSP3A单目显微镜(上海万衡精密光学仪器厂)。5-FU(常州剑湖化工有限公司，批号:061108，纯度≥99%)，空白SLN和5-FU-SLN(郑州大学纳米药物研究中心制备)，生理盐水(河南太龙药业股份有限公司，批号:090522242)。

1.2 动物与瘤株 健康昆明种小鼠(鼠龄4～5周，雌性，体质量18.0～22.0 g)购自河南省实验动物中心，动物生产许可证号:SCXK(豫)2005-0001;小鼠S180肉瘤腹水型瘤株为中国人民解放军军事医学科学院微生物与流行病研究所药学研究室馈赠。

1.3 5-FU-SLN的制备 精密称取处方量单硬脂酸甘油酯和氢化大豆卵磷脂，加入无水乙醇和氯仿混合溶液(1∶1)，55℃水浴溶解，得到脂质溶液。称取处方量5-FU，置超纯水中超声水浴溶解制成内水相，同时称取表面活性剂泊洛沙姆-188适量，溶于PBS溶液中作外水相;控制一定的滴速、转速，将内水相滴入脂质溶液中，形成W/O型混悬液，滴加完毕后超声分散;再将其滴入含表面活性剂的同温度外水相中，搅拌乳化，减压旋转蒸发，缓慢除去有机溶剂，200 W超声分散1 min，形成W/O/W型5-FU-SLN 混悬液［2-4］。

1.4 小鼠腹水瘤模型的建立 取冻存复苏的S180细胞株在体积分数为5%CO2恒温箱中培养，传至2代，用无菌生理盐水调节细胞数至1×107mL－1，无菌条件下每只小鼠腹腔注射0.2 mL。接种第7天，无菌条件下抽取S180荷瘤小鼠淡黄色癌性腹水，加无菌生理盐水调整细胞数至1×107mL－1的瘤细胞悬液，经体积分数为0.2%的台盼蓝染色，细胞存活率＞95%。

1.5 动物分组与给药方法 模型小鼠称质量后随机分为生理盐水对照组、空白SLN组(Blank-SLN组)、5-FU溶液组(5-FU葡萄糖溶液)及5-FU-SLN组，每组20只。5-FU溶液组和5-FU-SLN组给药剂量为20 mg/(kg·d)，生理盐水对照组、空白SLN组为等容量生理盐水和空白SLN悬液。均腹腔注射给药，1次/d，连续7 d。

1.6 检测指标 每天观察各组小鼠的一般情况，隔天测量体质量和腹围。末次给药后次日(第8天)，在无菌条件下颈椎脱臼处死各组半数小鼠，用注射器收集腹腔中全部腹水后，测量腹水体积，每只取0.4 mL新鲜腹水，台盼蓝染色后镜检计瘤细胞总数和瘤细胞存活率［2］。细胞存活率 =(未染色细胞数/细胞总数)×100%。处死的小鼠解剖观察腹腔内脏器的病理变化，肝脏组织用体积分数为10%的甲醛固定后，石蜡包埋，HE染色镜检。剩余小鼠停止治疗，统计平均生存时间，计算生命延长率。生命延长率=(给药组生存时间/生理盐水对照组生存时间－1)×100%。

1.7 统计学处理 采用SPSS 15.0进行分析，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较处理7 d后各组小鼠体质量、腹围、腹水量、瘤细胞数、瘤细胞存活率及平均生存时间和生命延长率。检验水准α=0.05。

表1 各组小鼠体质量及腹围的变化

表2 各组小鼠腹水量、瘤细胞数及瘤细胞存活率比较

2 结果

2.1 一般情况观察 给药期间，各组动物饲养环境相同，大部分存活，仅有个别死亡(生理盐水对照组死亡1只，Blank-SLN组死亡2只，5-FU溶液死亡1只)。开始给药后2～3 d，生理盐水对照组荷瘤鼠腹部迅速增大，至第4天时腹部膨隆，进食进水量明显减少，且活动减少，对外界刺激反应迟钝，出现活动受限、倦怠乏力等衰竭症状，晚期出现明显的球状腹，部分小鼠大便异常(便稀，脓血便)，尿液中出现淡黄色黏稠液。Blank-SLN组表现与生理盐水对照组相近，而5-FU溶液组和5-FU-SLN组小鼠腹部增大出现均较生理盐水对照组晚，且进展较慢，与正常小鼠相比差异不明显。

2.2 各组小鼠体质量和腹围的变化 见表1。

2.3 各组小鼠腹水量、瘤细胞数及瘤细胞存活率比较 生理盐水对照组和Blank-SLN组的小鼠有大量血性腹水，气味刺鼻;5-FU溶液组解剖后血性腹水量也较多;5-FU-SLN组有少量淡黄色腹水。各组小鼠腹水量、瘤细胞数及瘤细胞存活率见表2。

2.4 各组小鼠肝脏病理学检查 生理盐水对照组、Blank-SLN组及5-FU溶液组小鼠处死后解剖均发现肝脏表面光泽差，灰黄，边缘钝，各叶之间有粘连，质脆，有黏性物质和不同程度的淡黄色针尖样病灶。而5-FU-SLN组解剖后肝脏肉眼观察各叶之间未见粘连，质地较坚韧，切面未见明显充血、淤血和针尖样病灶。肝脏病理切片见图1。结果显示:生理盐水对照组、Blank-SLN组和5-FU溶液组肝脏组织可见较多核深染的癌细胞，排列紧密，有异型性(多边形、马蹄形及扁平型);胞核大，胞质较少，核质比明显异常，可见巢状结构;多数肝细胞坏死，细胞出现空泡型变性，核固缩现象多。而5-FU-SLN组肿瘤细胞浸润程度较轻，形态正常无塌陷，异型细胞少，肝脏细胞较为正常。

图1 各组小鼠肝脏病理形态学变化(HE，×200)

2.5 各组小鼠生存时间与生命延长率 见表3。

表3 各组小鼠生存时间及生命延长率比较

3 讨论

腹腔内化疗是一种选择性区域化疗方案，该方案能有效增加药物和腹膜的接触面积，提高局部药物浓度，而全身毒副作用较轻。作者发现:5-FU溶液组的体质量增长比5-FU-SLN组缓慢，腹围增长速度却比5-FU-SLN组快，可能是由于5-FU溶液腹腔内给药后药物选择性差，代谢快，对骨髓和胃肠道毒性较大，导致动物食欲减退，形体消瘦［5］。5-FUSLN组的腹水量、瘤细胞数都少于5-FU溶液组，且瘤细胞存活率低于5-FU溶液组，提示5-FU-SLN剂型腹腔给药对腹水瘤的抑制作用比5-FU溶液显著。5-FU-SLN在腹腔液内缓慢释放，瘤细胞长时间浸泡在化疗药物中，提高了瘤细胞毒作用，抑制腹腔内的肿瘤细胞增殖，有效地控制瘤细胞扩散，同时延长了小鼠的生存时间。5-FU-SLN组与5-FU溶液组相比未见肝脏转移，提示5-FU-SLN腹腔给药对肿瘤腹腔内脏器转移的抑制作用优于5-FU溶液。肝脏转移减少的原因可能是固体脂质纳米粒容易在肝、脾等网状内皮系统聚集，药物在肝、脾中的浓度高，从而抑制了肝脏转移［6-7］。

总之，作者的实验结果证实5-FU-SLN腹腔化疗在保持腹腔化疗优势的同时，对腹水的抑制作用增强，有效抑制肿瘤细胞的增殖，延长了动物的存活时间，且小鼠肿瘤细胞浸润程度减轻，肝脏细胞趋于正常。对于5-FU-SLN小鼠腹腔化疗的药代动力学与靶向性，有待下一步深入研究。

［1］陆彬.药物新剂型与新技术［M］.北京:人民卫生出版社，2002:329

［2］徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2002:1 757

［3］侯君，周世文.甘草酸固体脂质纳米粒的处方及制备工艺［J］.第三军医大学学报，2008，30(11):1 043

［4］王艳芝，郑甲信，徐炳欣，等.盐酸小檗碱固体脂质纳米粒包封率的聚结离心法测定［J］.郑州大学学报:医学版，2009，44(1):188

［5］姜福全，王强，蔡清萍，等.5-氟尿嘧啶腹腔内缓释化疗对H22腹水瘤小鼠的抑瘤疗效观察［J］.第二军医大学学报，2006，27(11):1 207

［6］Jain SK，Chaurasiya A，Gupta Y，et al.Development and characterization of 5-FU bearing ferritin appended solid lipid nanoparticles for tumour targeting［J］.J Microencapsul，2008，25(5):289

［7］Wong HL，Bendayan R，Rauth AM，et al.Chemotherapy with anticancer drugs encapsulated in solid lipid nanoparticles［J］.Adv Drug Deliv Rev，2007，59(6):491