脂质体介导的hTERT PEI/ASODN缩合体对乳癌MCF-7细胞生长及hTERT表达的影响*

权松霞，张振中，邵彦江，王晓娟，李惠翔#

1)郑州大学基础医学院病理学教研室;郑州大学第一附属医院病理科郑州450052 2)郑州大学药学院郑州450001

端粒酶(telomerase)是一种核蛋白酶，以其自身RNA为模板，逆转录合成端粒DNA，在染色体末端增加TTAGGG重复序列以补偿端粒的缩短，在绝大多数的细胞永生化和肿瘤的形成过程中起关键性作用［1］，针对端粒酶为靶点的肿瘤治疗策略是近年来研究的热点［2］。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是合成端粒酶的限速亚单位，它的表达量对端粒酶的活性调控起着决定性作用［1-4］。利用反义核酸技术，人工合成hTERT mRNA反义寡核苷酸(ASODN)抑制端粒酶的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，是目前肿瘤基因治疗的方向之一。未经修饰的寡核苷酸易被核酸酶降解，细胞摄入率低。聚乙烯亚胺(PEI)可将ASODN缩合成纳米大小的颗粒状物，有利于ASODN进入细胞内。但是，PEI具有明显的细胞毒性，而 PEI/ASODN缩合体在体内应用时会被单核吞噬细胞迅速清除。脂质体作为一种载体，可将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体后被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织或器官中积蓄，从而提高药效，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性［5］。作者以脂质体作为 hTERT PEI/ASODN缩合体的载体，观察其对乳癌MCF-7细胞生长和hTERT表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 缩合体由课题组自制。RPMI 1640培养基和胰蛋白酶购自Gibco公司，优级胎牛血清购自天津TBD公司，MTT为Amreseo公司产品，兔抗人hTERT多克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品，通用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，Trizol试剂为Sigma公司产品，其他化学试剂均为国产分析纯。梯度PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)，TCS-SP2型激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)，高速低温台式离心机(美国Beckman公司)，酶标仪(奥地利TECAN公司)。

1.2ASODN和正义寡核苷酸(SODN)的设计与合成 根据hTERT DNA基因序列(AF128893)设计ASODN， 序 列 为:5’-CCGCCCTCTCCTCGCG GCGCGAGTT-3’;作用位点是调节hTERT基因转录的Sp1蛋白的结合位点。另设计SODN序列作对照:5’-GAGCATTAGCACCGCGGGC-3’。经计算机网上 BLAST检索，上述 ASODN及 SODN序列与hTERT基因以外的人类基因均无同源性，均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3 细胞培养 人乳癌MCF-7细胞由河南省医药科学研究院王庆端教授提供。用含体积分数10%的灭活胎牛血清，含100 mg/L青霉素、链霉素的RPMI 1640培养基，在37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养，每2～3 d用2.5 g/L胰酶消化，换液传代。

1.4 缩合体摄取情况的观察 采用6孔板制备细胞爬片，转染前用无血清RPMI 1640冲洗3遍，每孔加入无血清RPMI 1640培养液800 μL，其中2孔加100 mg/L ASODN-荧光素各 200 μL，2 孔加 100 mg/L PEI/ASODN-荧光素各 200 μL，2 孔加 100 mg/L脂质体-PEI/ASODN-荧光素各200 μL，培养2 h后，弃转染液，PBS冲洗3遍，用体积分数75%的冰乙醇固定30 min，取出细胞爬片，置于载玻片上，采用激光共聚焦扫描显微镜于透射模式观察细胞轮廓及形态，激光激发模式(激发波长488 nm)下观察缩合体摄入情况。

1.5 细胞转染 取处于对数生长期的细胞，于转染前1 d，96孔板按8×103/孔、6 孔板按2 ×105/孔接种细胞，置培养箱中培养过夜。转染前用无血清RPMI 1640洗板2次。实验分9组:空白对照组、ASODN 组(20 mg/L)、SODN 组(20 mg/L)、溶媒组、空白脂质体组、PEI/ASODN组(20 mg/L)、PEI/SODN组(20 mg/L)、脂质体-PEI/ASODN组(20 mg/L)和脂质体-PEI/SODN组(20 mg/L)。各组试药用无血清培养液按比例稀释后小心滴入细胞并充分混匀，培养4 h后，弃转染液，PBS冲洗3遍后更换正常含血清及RPMI 1640培养基，并进行以下观察。

1.6 细胞形态学观察 在细胞培养状态下，用倒置显微镜观察各组细胞转染24 h生长状态及形态学变化。

1.7 细胞的生长情况 取出分别培养24、48和72 h的各组细胞，每孔加入终浓度为5 g/L的MTT溶液 20 μL，4 h 后加入二甲基亚砜 150 μL，振荡 10 min，用酶标仪测492 nm处的光密度值。

1.8 hTERT蛋白的检测 采用免疫细胞化学法。制备各组转染48 h后的细胞爬片，使用免疫细胞化学SP法检测hTERT蛋白的表达。一抗为兔抗人hTERT多克隆抗体(工作浓度1∶100)，按试剂说明书操作，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下观察，阳性结果为胞核或胞质着棕黄色。

1.9 hTERT mRNA水平测定 采用RT-PCR法。hTERT基因PCR扩增引物参照文献［3］，并经Gen-Bank检索证实。hTERT上游引物:5’-CGGAAGA GTGTCTCCAGCAA-3’，下 游 引 物:5’-GGAT GAAGCGGAGTCTGGA-3’，扩增片段长度为145 bp。内参 β-actin上游引物:5’-CAAGGCCAACCGC GAGAAGATG-3’，下 游 引 物:5’-GTCCAGGGCG ACGTAGCACAGC-3’，扩增片段长度330 bp。上述引物均由上海博兴公司合成。各组细胞于转染48 h后应用Trizol试剂盒提取总RNA，逆转录得cDNA，用于PCR。扩增条件:50℃逆转录30 min，94℃逆转录酶失活2 min;94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸90 s，35个循环;72℃延伸6 min。扩增产物点样于20 g/L琼脂糖凝胶，应用凝胶成像分析处理系统摄像。

1.10 统计学处理 采用SPSS 11.0处理数据。各组细胞转染24、48和72 h光密度值的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 体外摄取实验观察结果 单纯的ASODN转染时细胞内荧光强度极弱;PEI/ASODN组、脂质体-PEI/ASODN复合物转染细胞2 h后，可见大量荧光物质聚集在细胞核中。见图1。

2.2 形态学观察结果 空白对照组、ASODN组、SODN组、溶媒组、空白脂质体组、脂质体-PEI/SODN组均生长状态良好;PEI/SODN组、PEI/ASODN组在转染4 h后，可见细胞表面黏附大量大小相似的颗粒;脂质体-PEI/ASODN组转染后随时间的延长，细胞体积变小，形态狭长，间隙增大，连接松散，贴壁细胞逐渐变圆、漂浮。见图2。

2.3 细胞的生长情况 各组细胞转染24、48和72 h后，MTT法测得的光密度值比较见表1。

表1 各组细胞转染24、48和72 h的光密度值比较(n=3)

2.4 转染细胞hTERT mRNA检测结果 见图3。

图3 转染48 h后各组细胞hTERT mRNA的表达

2.5 转染细胞hTERT蛋白检测结果 转染48 h时，空白对照组、ASODN组、SODN组、溶媒组、空白脂质体组、PEI/SODN组及脂质体-PEI/SODN组细胞为阳性着色;PEI/ASODN及脂质体-PEI/ASODN组细胞为阴性着色。见图4。

图4 转染48 h后各组细胞hTERT蛋白的表达(免疫细胞化学SP法，×400)

3 讨论

反义核酸技术是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成的特定的反义核酸来抑制或封闭基因表达的技术［4］，但是未经修饰的寡核苷酸易被胞内核酸酶降解。该研究运用PEI将ASODN有效压缩以后，制备成氮磷比为10的PEI-ASODN纳米微粒缩合体，再用中性脂质体将其有效包裹后，转染人乳癌MCF-7细胞。实验表明:该载体可以有效进入细胞内，并抑制细胞的生长，这与多数学者的研究结果相似［6］。PEI/ASODN、PEI/SODN 也显示出较强的抑制MCF-7细胞生长的作用，但在转染4 h后，可见细胞表面黏附大量大小相似的颗粒，与文献［7］报道一致，即PEI在细胞膜上可形成2～6 μm的团片状物，而脂质体-PEI/SODN组和脂质体-PEI/ASODN组并无此种表现，说明中性脂质体通过对PEI/SODN或PEI-ASODN的有效包裹，很好地降低了PEI的细胞毒性。此外，该研究还显示，hTERT ASODN作用于MCF-7细胞48 h后hTERT基因表达未被完全抑制，表明 hTERT ASODN只能下调hTERT基因的表达，并不能完全封闭该基因。这一结果进一步证实hTERT的调控是非常复杂的，要结合其他的细胞调控途径综合评价。

总之，该研究结果显示hTERT基因的ASODN以序列特异性方式抑制基因的表达，从而抑制端粒酶活性，证实了中性脂质体作为载体的有效性和安全性;可以通过对中性脂质体进行修饰及与特定细胞表面受体的配体相偶联，达到靶向性基因转染的目的，为肿瘤靶向性的基因治疗的体内研究提供一种新的方法。

［1］Cong YS，Wright WE，Shay JW.Human telomerase and its regulation［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2002，66(3):407

［2］Greider CW.Telomerase activity cell，proliferation and cancer［J］.Proc Natl Acid Sci USA，1998，95(1):90

［3］Takakura M，Kyo S，Tanaya M，et al.Expression of human telomerase subunits and correlation with telomerase activity in cervical cancer［J］.Cancer Res，1998，58(7):1 558

［4］Tao M，Miyano Kurosaki N，Takai K，et al.Specific inhibition of human telomerase activity by transfection reagent，FuGENE6-antisense phosphorothioate oligonucleotide complex in Hela cells［J］.FEBS Lett，1999，454(3):312

［5］Harada-Shiba M，Yamauchi K，Harada A，et al.Polyion Complex micelles as vectors in gene therapy-pharmacokinetics and in vivo gene transfer［J］.Gene Ther，2002，9(6):407

［6］Herbert BS，Pongracz K，Shay JW，et al.Oligonucleotide N3’→P5’phosphoramidates as efficient telomerase inhibitions［J］.Oncogene，2002，21(4):638

［7］李经忠，王青青，余海.新型非病毒载体聚乙烯亚胺介导基因转染参数的研究［J］.中国生物医学工程学报，2006，25(4):481