RNA干扰对人食管癌裸鼠移植瘤组织中血管内皮生长因子C表达的影响*

巴玉峰，宋一民，李 印#，张红新，李素红，陈奎生，张云汉

1)河南省肿瘤医院胸外科郑州450003 2)郑州大学第一附属医院病理科;河南省肿瘤病理重点实验室郑州450052

淋巴道转移是人食管癌转移的主要方式，且与患者的预后密切相关［1］。血管内皮生长因子-C(vascular endothelial factor C，VEGF-C)可诱导淋巴管增生，促进肿瘤淋巴道转移，被称为特异性的淋巴管 生 成 因 子［2］。RNA 干 扰 (RNA interference，RNAi)是一种新兴的基因治疗技术，具有高效性和高度特异性［3］。作者构建了以人VEGF-C基因为靶标的小分子干扰RNA(siRNA)质粒，经阳离子脂质体介导转染人食管癌EC9706细胞，并移植于裸鼠皮下形成移植瘤，观察移植瘤组织中VEGF-C的表达情况，为进一步探讨食管癌淋巴道转移机制及以抗淋巴管生成为靶点的食管癌基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管癌EC9706细胞系(中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠)。T细胞免疫缺陷的BALB/c SPF SR雌性裸鼠25只(中国医学科学院实验动物研究所提供)，鼠龄4～6周，体质量18～22 g。Trizol(Invitrogen公司)，RT-PCR一步法试剂盒(TaKaRa公司)，RT-PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。VEGFC兔抗人多克隆抗体和SP免疫组化试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。RPMI 1640(海克隆生物化学制品北京有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)。HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统为同济医科大学千屏影像工程公司产品。冯氏IVC-Ⅱ型独立送风隔离笼具(苏州市冯氏实验动物设备有限公司)。

1.2 siRNA转染EC9706细胞 根据VEGF-C cDNA已知序列(NM_005429)，参照文献［4］的方法，利用Ambion和TaKaRa等公司网站提供的设计分析软件，设计并体外转录合成3条含19个核苷酸的siRNA(HX1、HX2和 HX3)和1条无关序列 siRNA(HX4)，序列见表1。

表1 寡核苷酸序列

导入pSINsi-U6载体，得到发卡样siRNA表达重组质粒。重悬EC9706细胞于RPMI 1640培养液中，以每孔5×105个细胞接种于6孔板，培养24 h使之贴壁生长，当融合达90%时，参照脂质体法转染试剂盒说明书分组进行转染，分别是空白对照组(仅加脂质体)、pSINsi-U6-HX1组、pSINsi-U6-HX2组、pSINsi-U6-HX3组、无关序列转染组和未转染对照组。转染48 h后，换含800 mg/L G418培养液继续培养进行抗性筛选，1周内空白对照组和未转染对照组细胞全部死亡，其余各组也有80% ～90%的细胞死亡，换用含400 mg/L G418培养液筛选抗性克隆至2周后，挑选阳性克隆，传代至培养瓶中继续常规扩大培养。

1.3 裸鼠移植瘤模型的建立 裸鼠随机分为5组，分别为HX-1、2、3转染组和无关序列转染组以及未转染对照组。将1.2中转染siRNA质粒的各组EC9706细胞传代并常规扩大培养，2 g/L胰蛋白酶消化、吹打、无菌生理盐水重悬制成细胞悬液，注射于裸鼠腋窝皮下(2×106个/只)，动物接种后3～5 d即可见到明显肿块突起，SPF环境中饲养4周后处死。

1.4 观测指标

1.4.1 移植瘤体积和质量测定 颈椎脱臼处死荷瘤裸鼠，剥离移植瘤，洗净并称量。

1.4.2 移植瘤组织中VEGF-C蛋白检测 采用免疫组化SP法测定，按照试剂盒说明操作。取移植瘤组织，常规制片，依次滴加工作液和VEGF-C多克隆抗体(稀释度为1∶150)，中止反应后苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照，并按说明书推荐的结肠癌标本作阳性对照。VEGF-C蛋白阳性染色为淡黄色或棕深黄色颗粒，定位于细胞质内。每组切片用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统在高倍视野下计数10个视野，并避开移植瘤坏死区域，对肿瘤细胞进行体视学参数——阳性单位(positive unit，PU)测定。PU越大，表示目标物阳性表达强度越高;反之，表达强度越低［5］。

1.4.3 移植瘤组织中VEGF-C mRNA检测 用Trizol提取移植瘤组织总RNA，RT-PCR检测各组细胞中VEGF-C mRNA 的方法参照文献［6］，VEGF-C 引物序列:上游 5’-AAGGAGGCTGGCAACATAAC-3’，下游5’-CCACATCTGTAGACGGACAC-3’，扩增产物大小 229 bp;β-actin引物序列:上游 5’-CATCCT GCGTCTGGACCT-3’，下游 5’-TCAGGAGGAGCAAT GATCTTG-3’，扩增产物大小480 bp。目的基因与内参照物引物同管扩增，按以下条件进行RT-PCR反应:50℃ 30 min，94℃预变性2 min，94℃变性30 s，57.8 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，共进行 35 个循环。取5 μL扩增产物与2 μL上样缓冲液混匀，在12 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察并用凝胶成像分析系统扫描，以VEGF-C与β-actin条带灰度值的比值表示目的片段的相对表达量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 10.0进行统计分析。对5组移植瘤体积、质量、VEGF-C蛋白的 PU及mRNA相对表达量进行正态性、方差齐性检验及单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α =0.05。

2 结果

2.1 5组移植瘤体积及质量的比较 见表2。

2.25 组移植瘤组织中VEGF-C mRNA的表达见图1、表2。

图1 移植瘤组织中VEGF-C mRNA的表达

2.3 5组移植瘤组织中VEGF-C蛋白的表达 见图2与表2。

图2 移植瘤组织中VEGF-C蛋白的表达(SP，×400)

表2 5组移植瘤体积、质量、VEGF-C mRNA及蛋白测定结果(n=5)

3 讨论

RNAi是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的序列特异性基因转录后的沉默过程，可以破坏特定目的基因转录的mRNA，使其功能沉默，而对其他正常基因无影响。RNAi应用不仅为基因功能研究提供了简单有效的“基因敲除”手段，同时还为病毒感染性疾病、遗传性疾病及肿瘤的基因治疗开辟了新途径［7］。

近年来，国内对于VEGF-C与食管鳞状细胞癌淋巴道转移关系的研究开展较多，均认为食管鳞状细胞癌组织中VEGF-C的高表达与淋巴结转移关系密切，且呈正相关［6，8-9］。谢晓斌等［10］应用靶向 VEGF-C 的短发夹RNA(shRNA)对乳癌细胞生物学特性进行了研究，发现VEGF-C shRNA重组质粒载体在乳癌MCF-7细胞中能高效、特异地发挥靶基因沉默作用。

作者将稳定转染VEGF-C siRNA表达质粒的食管癌EC9706细胞注射于裸鼠皮下，成功构建了移植瘤，并用RT-PCR、免疫组化和体视学技术证明，转染靶向VEGF-C的siRNA表达载体的EC9706细胞形成的移植瘤组织中VEGF-C mRNA和蛋白表达受抑，尤其是HX2转染组移植瘤组织中不仅有VEGF-C蛋白与mRNA的表达下调，瘤组织体积和质量也均有所减小，可能是由于VEGF-C系VEGF家族成员，该段序列与VEGF-A同源，从而发挥了抑制生长的生理功能，这也为针对VEGF-C的RNAi提供了一种新思路。HX1、2、3转染组移植瘤组织中仍可检出VEGF-C mRNA弱表达，可能与所用RNAi质粒沉默VEGF-C mRNA表达的效率达不到100%有关。

总之，从体内实验的角度证实，设计和构建的抗VEGF-C表达的siRNA载体可有效抑制食管癌EC9706细胞产生VEGF-C的特性，为食管癌抗淋巴管生成的基因治疗提供了理论依据。

［1］杜百廉.食管癌［M］.北京:中国科学技术出版社，1994:188

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［5］牛海艳，申洪.ABCG2在肺癌中表达的定量研究［J］.中国体视学与图像分析，2007，12(3):167

［6］张红新，张岚，贺付成.人食管鳞癌中血管内皮生长因子C mRNA的表达及其临床意义［J］.中国现代医学杂志，2006，16(24):3 697

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