胃癌淋巴结转移灶对顺铂体外化疗的药敏性及多种耐药相关因子的表达*

吕品田，檀碧波，刘 斌，韩 杰#

1)河北省人民医院肿瘤科石家庄050051 2)河北省人民医院胃肠外科石家庄050051

顺铂(cisplatin，DDP)作为胃癌化疗的常用一线药物，在胃癌综合治疗中起重要作用，但肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)现象的存在严重影响了其化疗效果，了解DDP化疗药敏性与耐药相关因子表达的关系对预测化疗疗效有重要意义。胃癌转移灶MDR与原发灶相比具有异质性，进展期胃癌切除术后化疗的目标应针对转移灶和(或)残留病灶［1-3］，而关于胃癌淋巴结转移灶 DDP药敏性与MDR相关因子表达关系的研究尚未见报道。由于胃癌MDR涉及多种机制及耐药相关基因/蛋白，故作者对胃癌原发灶、淋巴结转移灶DDP体外化疗药敏性与多种MDR相关因子表达进行多因素分析，以筛选与DDP耐药性关系密切的耐药因子。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2006年10月至2008年5月在河北省人民医院手术并经病理证实伴淋巴结转移的胃癌患者54例，其中男32例，女22例，年龄36.0～80.0(62.6±15.8)岁。所有病例术前均未接受放、化疗。

1.2 肿瘤细胞的培养及化疗药敏性实验 术中标本离体后分别取新鲜肿瘤组织、相应转移淋巴结1～2 枚(均1.0 cm × 0.5 cm ×0.5 cm)置入双抗(青霉素G钠100 kU/L、链霉素200 mg/L)培养液，2 h内行原代细胞培养化疗药物敏感实验。分别将肿瘤原发灶、转移淋巴结组织经研磨分散，用细胞分离器调细胞密度为5×105mL－1。培养前将肿瘤药敏检测板和DMEM培养基预温至37℃。化疗药物DDP为齐鲁制药有限公司产品(10 mg/支)，药物终质量浓度为血浆峰值浓度(4.0 mg/L)［4］。以不加药物的细胞为对照。设3个复孔，接种细胞悬液200 μL/孔，微量振荡器振荡混匀，置于37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度的培养箱培养48 h，加噻唑蓝(MTT，5 g/L)20 μL/孔，继续培养 3 ～24 h，1 000 r/min离心10 min，弃上清，吸水纸吸去残留液体，加入DMSO 100 μL/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪570 nm测各孔吸光度(A)，计算肿瘤细胞生长抑制率(IR)。IR=(1－给药孔A/对照A)×100%。

1.3 肿瘤原发灶、相应淋巴结转移灶中P-gp、GST-π、P53、Survivin、Bcl-2和 Bax蛋白表达的免疫组织化学测定 鼠抗人 P-gp、GST-π、P53、Survivin、Bcl-2及Bax单克隆抗体和免疫组织化学染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司(美国Zymed公司产品)，采用SP法分别对肿瘤原发灶、相应淋巴结转移灶进行上述指标的免疫组织化学染色，严格按照试剂盒说明书进行操作。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。由2位病理医师分别双盲阅片进行结果判断。每张切片取5个高倍视野，每视野计数100个细胞，P-gp、GST-π、Survivin、Bcl-2及Bax以胞膜和(或)胞质、P53以胞核着黄色为阳性，按肿瘤细胞着色强度和阳性细胞率分别进行计分。着色强度计分:无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分;阳性细胞率计分:阳性细胞≤5%为0分，～25%为1分，～50%为2分，～75%为3分，＞75%为4分。2项分值的乘积为0或1分表示阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为阳性(⧺)，≥7分为强阳性(⧻)。

1.4 统计学处理 应用SAS 8.0分析实验数据。计量资料采用配对t检验，等级资料采用Wilcoxon配对秩和检验和Spearman等级相关分析，以CDDP对肿瘤细胞的药物抑制率为因变量(^y)、多种耐药相关因子的表达强度为自变量(P-gp为X1，GST-π为 X2，P53 为 X3，Survivin 为 X4，Bcl-2 为 X5，Bax为X6)建立多重线性回归模型，分析胃癌原发灶、淋巴结转移灶之间DDP抑制率与耐药相关因子表达的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 DDP对胃癌淋巴结转移灶、原发灶肿瘤细胞抑制率的比较 DDP对原发灶中胃癌细胞的IR为(27.04±8.37)%，对淋巴结转移灶胃癌细胞的IR为(26.10±10.03)%，差异无统计学意义(t=0.530，P=0.597)。

2.2 胃癌原发灶、淋巴结转移灶之间DDP抑制率与耐药相关因子表达的关系 原发灶中药物抑制率仅与GST-π 有关，回归方程为^y=33.894 16 －2.937 X2，GST-π表达水平越高药物抑制率越低(β=－2.937，P=0.010)。转移淋巴结中药物抑制率与P53、Survivin、Bcl-2表达有线性回归关系，所得回归方程为:^y=34.06+2.013X3－2.652X4－3.466X5;P53表达水平越高药物抑制率越高(β=2.015，P=0.026)，而Survivin、Bcl-2表达水平越高药物抑制率也越低(β = －2.652，－3.466，P 分别为 0.046 和0.002)。

2.3 胃癌原发灶、淋巴结转移灶间耐药相关因子表达强度 见图1、表1。

图1 胃癌原发灶(A)、淋巴结转移灶(B)中耐药相关因子的表达(SP，×400)

表1 胃癌原发灶和淋巴结转移灶中耐药相关因子的表达情况

3 讨论

DDP为胃癌化疗的一线抗癌药物，主要靶分子是肿瘤细胞的DNA，该药通过与DNA结合形成交叉键，破坏DNA的复制而发挥抗肿瘤作用，但肿瘤对DDP存在的耐药现象严重影响了其疗效，甚至导致化疗失败。作者的研究结果显示，DDP对胃癌原发灶和淋巴结转移灶的肿瘤细胞抑制率均不足30.00%，提示胃癌细胞对DDP存在明显的原发性耐药现象，逆转肿瘤细胞对DDP的耐药性有可能提高化疗的有效率并改善预后。

肿瘤的MDR涉及多种基因/蛋白表达和不同信号转导通路协调的级联样网络式调节机制。目前发现与胃癌耐药相关的因子有调节细胞凋亡的凋亡抑制蛋白 P53［5］、Survivin［6］及 Bcl-2［7］等，另外促凋亡蛋白 Bax［8］、具有解毒功能的 GST-π［9］和具有药泵作用的MDR1/P-gp［10］等也在胃癌MDR中发挥作用。故该研究通过创建多元线性回归模型，分析这6种因子的表达与DDP对胃癌原发及转移灶肿瘤细胞抑制率的关系。结果发现原发灶中DDP对肿瘤细胞抑制率仅与GST-π呈负相关，在转移灶中则与Survivin、Bcl-2呈负相关，而与P53呈正相关。作者还对比分析了胃癌原发灶与淋巴结转移淋灶中6种MDR相关因子的表达，结果显示，P-gp、GST、Bcl-2和Bax在淋巴结转移灶中的表达强于原发灶，GST-π、Survivin在2种癌灶中的表达强度均无相关性。这一结果提示，在胃癌原发灶和转移灶之间存在MDR异质性，影响胃癌转移灶DDP抑制率的主要耐药相关因子与原发灶不同，与作者前期的研究［2］结果相符。

该结果中转移灶P53表达与DDP对肿瘤细胞抑制率呈正相关，与突变型P53抑制细胞凋亡的功能［5］不符，推测这可能是由于P53表达作为细胞恶变的早期分子事件，仅在肿瘤早期起作用;另外，P53在肿瘤侵袭转移过程中受诸多其他因子影响，作用有所改变，且作者建立的多重线性回归模型也可能造成结果与单因素分析不同。这更说明胃癌MDR的复杂性和建立准确多元线性回归模型的必要性。

该研究初步证实了胃癌原发灶、淋巴结转移灶中肿瘤细胞对DDP均存在明显的耐药性，原发灶与转移灶中影响DDP药敏性的MDR相关因子不同，但目前关于胃癌MDR的形成机制尚未完全明确，尚有许多其他因子及信号转导通路参与其中。

［1］韩杰，吕炳蓉，檀碧波，等.消化道肿瘤淋巴结转移灶多药耐药性的变化及其意义［J］.中华实验外科杂志，2006，23(12):1 495

［2］韩杰，檀碧波，王安峰，等.消化道肿瘤淋巴结转移灶P-gp、GST-π和凋亡抑制蛋白表达的特点［J］.中华外科杂志，2009，47(2):106

［3］Donnenberg VS，Landreneau RJ，Donnenberg AD.Tumorigenic stem and progenitor cells:implications for the therapeutic index of anti-cancer agents［J］.J Control Release，2007，122(3):385

［4］韩杰，檀碧波，耿玮，等.消化道肿瘤组织中P-gp、凋亡抑制蛋白表达与体外化疗药敏性的关系及其意义［J］.癌症，2008，27(11):1 166

［5］Lopes RB，Gangeswaran R，McNeish IA，et al.Expression of the IAP protein family is dysregulated in pancreatic cancer cells and is important for resistance to chemotherapy［J］.Int J Cancer，2007，120(11):2 344

［6］常方方，高明，周云.奥沙利铂联合顺铂对体外培养BGC-823细胞增殖及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响［J］.郑州大学学报:医学版，2009，44(2):359

［7］檀碧波，韩杰，吕炳蓉，等.消化道肿瘤原发灶、淋巴结转移灶中p53、P-糖蛋白的表达及意义［J］.山东医药，2007，47(21):83

［8］孙延霞，杨绍娟，高申，等.siRNA沉默survivin对人胃癌SGC7901细胞生长的抑制作用［J］.吉林大学学报:医学版，2008，34(3):477

［9］Yu ST，Chen TM，Chern JW，et al.Downregulation of GSTpi expression by tryptanthrin contributing to sensitization of doxorubicin-resistant MCF-7 cells through c-jun NH2-terminal kinase-mediated apoptosis［J］.Anticancer Drugs，2009，20(5):382

［10］Fukuda K，Saikawa Y，Ohashi M，et al.Tumor initiating potential of side population cells in human gastric cancer［J］.Int J Oncol，2009，34(5):1 201