蛋鸡致病性大肠杆菌的分离与药敏试验

周 斌，杜俊成

（湖北省襄樊职业技术学院生物工程学院，湖北 襄樊 441050）

2009年4月初，襄樊附近某家养殖场的蛋鸡发病，并有死亡。通过临床症状和病理解剖初诊为大肠杆菌病。从现场采集病死鸡，经解剖无菌采集病料，通过病原分离和生化培养等试验，最终确定病原体为禽致病性大肠杆菌，分离的大肠杆菌用临床常用的抗生素进行药敏试验。根据药敏结果合理选择药物，有效控制了该鸡场的病情。

1 材料

1.1 病料来源 无菌采集养殖场病死鸡的肝脏、心脏、脾、十二指肠等样本。

1.2 主要培养基及试剂 血液培养基、麦康凯培养基、普通培养基，细菌生化鉴定管，肠杆菌科细菌生化常规微量鉴定管（杭州微生物试剂有限公司）；试剂：细菌生化微量试验试剂盒（杭州微生物试剂有限公司），革兰氏染液（自配），以及解剖器械等。

1.3 药敏纸片 用常用的氧氟沙星、氨卞西林、乙酰甲喹、庆大霉素、丁胺卡那、氟苯尼考、阿莫仙、头孢噻肟钠、头孢塞呋、链霉素、环丙沙星、卡那霉素、强力霉素、替米考星、粘菌素、诺美沙星、恩诺沙星、泰乐菌素进行药敏试验。

1.4 主要试验设备 恒温培养箱、生物显微镜、无菌工作台、高压灭菌锅、pH纸、电炉、冰箱。

1.5 试验动物 健康的小白鼠。

2 方法

2.1 动物解剖 从发病场采集病鸡和病死鸡进行解剖，先观察活鸡的外部症状，其表现为精神沉郁、呆立、昏睡闭眼、共济失调、下痢。剖检可见心外膜、冠状脂肪出血，蛋鸡卵子有大量的血斑、出血、水肿。

2.2 细菌的分离培养 无菌采集病死鸡的肝脏、心脏、脾、十二指肠等样本，分别划线接种于麦康凯培养基和血液培养基上，于37℃恒温箱中培养18～24 h。

2.3 纯培养 挑取麦康凯培养基上粉红色的单个菌落在麦康凯培养基上划线纯培养，再将纯培养物接种到普通培养基上，于37℃恒温培养18～24 h，取出置于4℃下保存备用。

2.4 细菌染色镜检 用灭菌接种环挑取麦康凯培养基和血液培养基的单个菌落进行革兰氏染色。

2.5 生化试验 挑取上述麦康凯培养基或血液培养基的菌落接种到大肠杆菌培养基上，于37℃恒温箱中培养18～24h，观察细菌在培养基上生长的基本特征。参照生化鉴定的使用说明书，挑取麦康凯培养基或血液培养基的单个菌落接种到肠杆菌科细菌生化常规鉴定管内，于37℃恒温箱中培养，按规定时间对菌株的生化结果进行判断。

2.6 药敏试验 用2.5～3mL的生理盐水注入纯培养培养基里将细菌洗涂均匀后，均匀涂布在整个普通培养基上，待普通培养基上的菌液稍干后，将药片依次均匀贴放到平板上，药片与药片之间相距1～2 cm，药片距平板边缘1 cm，将平皿倒置37℃培养16～18h后观察结果，并测量抑菌圈的直径。

3 结果

3.1 细菌的培养特性 病料在血液培养基上生长良好，形成一种圆形凸突，光滑湿润，边缘整齐，半透明，呈中等大小的灰白色菌落。在麦康凯培养基上形成直径为1～2mm左右，光滑湿润的红色菌落。

3.2 染色镜检结果 为革兰氏阴性小杆菌，两端钝圆，散在或成对存在。

3.3 生化试验结果 分离菌株的生化试验结果见表1。分离菌株的生化特性完全符合大肠杆菌的特性。综合解剖症状、培养特征、镜检特征、生化试验结果，可鉴定此分离菌株为致病性大肠杆菌。

表1 生化试验结果

3.4 药敏结果 见表2

3.5 动物试验结果 给小白鼠注射此细菌24～48h内全部死亡，剖检死亡小白鼠，发现其肝脏肿胀出血，心外膜出血，对死亡小白鼠的肝脏、心脏等病料进行涂片镜检，所观察到的菌株与原分离细菌一致，说明此菌株为致病性大肠杆菌。

表2 药敏试验结果

4 小结与讨论

4.1 根据解剖症状、培养特征、镜检特征、生化试验结果，可判断此分离菌株为致病性大肠杆菌。鸡的大肠杆菌是由大肠杆菌某些血清型菌株引起的一类疾病的总称。本病一年四季均可发生，各个品种、日龄都可发病，但雉鸡最易感染，发病率可达30%～60%，死亡率可达100%。

4.2 大肠杆菌是革兰氏阴性菌中最易产生耐药性的细菌，由于近年来抗菌药使用频繁，不合理使用及加大量使用，甚至滥用，使得临床耐药菌株不断增加。由于不同地区的致病性大肠杆菌可能不同，若要控制当地病情，减少损失，就应及时分离出病原并进行药物敏感性试验，选出敏感药物进行防治。

通过对襄樊某养殖场临床分离的致病性大肠杆菌进行药物敏感性试验，得出该致病性大肠杆菌菌株对氧氟沙星、丁胺卡那、恩诺沙星、氟苯尼考、庆大霉素、粘菌素高度敏感，对乙酰甲喹、环丙沙星、卡那霉素、阿莫仙、头孢塞呋有较强的耐药，对泰乐菌素、头孢噻肟钠、强力霉素、链霉素、替米考星、氨卞西林耐药。这些结果与何敏等报道的河南地区致病性大肠杆菌的耐药性差异较大，其结果是对头孢噻呋、粘菌素仍较敏感，这可能与不同地区的饲养管理、药物的经验性使用及饲养环境不同有关。

根据药敏结果选择高敏感药物氟苯尼考的可溶性粉剂对全场鸡混饮（100mg/L），每天2次，每次饮水2 h，连用1周；同时加强鸡舍环境卫生消毒，加强温度、湿度、通风管理等，有效地控制了鸡只死亡，渐渐使鸡场整个病情有所好转。

[1]WS/T125-1999.中华人民共和国卫生行业标准——纸片法抗菌药物敏感试验标准[S].中华人民共和国卫生部，2000.

[2]韩文俞.病原细菌检验技术[M].长春：吉林科学技术出版社，1992.

[3]何 敏.河南信阳鸡场大肠杆菌耐药性调查[J].中国家禽，2010.