高碳酸酸化预处理对脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响*

罗和国,常业恬,邹望远,邹定全,王德明

(1.江西省人民医院麻醉科,南昌330006;2.中南大学湘雅二医院麻醉科,长沙410011)

研究表明缺血缺氧预处理对血管内皮细胞(endothelial cells,EC)具有保护作用,减少血管内皮细胞的凋亡,促进慢性缺血心肌内的血管生成。缺血或是缺氧预处理的临床应用受到限制。高碳酸酸化可激活EC的KATP通道,保护EC[1]。其对EC凋亡的影响尚未可知,本研究拟通过观测高碳酸酸化预处理后缺氧复氧EC凋亡的变化,来进一步证实高碳酸酸化预处理的血管保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 DM EM培养基购自美国Gibco公司,RNase购自美国Genview公司,人脐静脉EC来源于人脐静脉内皮细胞系:ECV-304,30～50代,购自中南大学湘雅医学院细胞中心。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养 细胞复苏:将EC冻存管从液氮罐中取出,快速于37℃水浴中使其完全融解后,1 000 r/min离心5 min,将冻存液于超净台中弃去,将DMEM完全培养基逐滴加入冻存管,将细胞重悬,再将细胞悬液缓慢加入已加好培养基的培养瓶中,放入 5%CO2、37℃培养箱中培养,24 h后换液。细胞传代:当EC对数生长至细胞密度达80%左右传代。弃去培养瓶内旧培养基,用D-Hank′s液漂洗 3次,加0.25%胰蛋白酶1 mL于瓶中,使细胞充分接触消化液,镜下见EC变圆、分散、部分脱离瓶底后,加5 mL完全培养基终止消化,用吸管吹打细胞悬液,将此瓶细胞悬液分成2份加入新瓶中,各瓶再加4 mL完全培养基,放入培养箱中继续培养。

1.2.2 实验分组 脐静脉EC培养传代后按处理方式不同分为6组(n=12):正常对照组(C组),缺氧复氧组(H/R组),缺氧预处理组(HPC组),30%CO2预处理 EC 10、30、60 min组(10、30、60 min HCA 组)。H/R 组将细胞置于 95%N2、5%CO2的缺氧培养箱中缺氧培养 4 h,再在 21%O2、5%CO2、74%N2的正常培养箱中复氧孵育24 h。HPC组将细胞置于缺氧培养箱中先行2个循环的缺氧10 h及正常培养箱中复氧10 h,其余处理方法同H/R组。10、30、60 min HCA组将细胞置于21%O2、30%CO2、49%N2培养箱中先行高碳酸酸化预处理10、30、60 min,其余处理方法同 H/R组。C组将细胞置于正常培养箱至实验结束。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 细胞形态学观察 光学检查:用倒置显微镜观察细胞,并照相。

1.2.3.2 Hoechst 33342染色 倒去EC细胞培养瓶中的液体,PBS洗2次;用 10%甲醛浸泡 5 min,吸去甲醛,加入 PBS浸泡 5 min,吸去甲醛,重复 3次;加入4 mL PBS,加入 4 μ L Hoechest工作液;避光染色25 min,吸去染液,用PBS浸泡 1～2 min,吸去 PBS,重复3次;加入适量PBS盖住细胞,于荧光显微镜下观察细胞。

1.2.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 将EC以3×104个/mL密度接种于25 mL培养瓶中,10%血清培养过夜,细胞贴壁后换2%血清进行不同培养环境的干预,干预结束后继续在正常培养箱中培养24 h,用胰蛋白酶消化细胞,制成单细胞悬液,然后1 000 r/min离心5 min,弃上清液,将收集的细胞用 4℃预冷的70%冷乙醇固定,4℃保存,至少固定18 h,调整细胞浓度为106个/mL,取 1 mL细胞悬液,用PBS洗 3次,细胞重悬于1 mL PI染液中,37℃孵育30 min即可进行流式分析。用流式细胞仪检测凋亡细胞占所测细胞总数的百分比,即凋亡指数(AI)。PI染液终浓度为 50 μ g/mL,RNase A终浓度为 20 μ g/mL。每组样本数量为 12。

2 结 果

2.1 培养EC的一般特征 正常EC在倒置生物显微镜下为多角形或短梭形,接种培养6 h后EC开始贴壁生长,胞浆致密,呈网状,8 h活细胞已全部贴壁,贴壁后的细胞开始分裂成簇,细胞生长旺盛,细胞簇面积增大,并向周围伸出放射状突起,相互连接成网(彩插Ⅰ图1、2)。

2.2 凋亡细胞的形态学改变 经Hoechest染色后可见凋亡细胞的核浓缩、皱裂(彩插Ⅰ图3、4)。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 HPC组,10、30、60 min HCA组凋亡指数小于H/R组,P＜0.01。30 min HCA组的凋亡指数小于10 min HCA组,P＜0.01。30 min HCA组的凋亡指数小于60 min HCA组,P＜0.05(表1)。

表1 各组细胞凋亡指数

3 讨 论

细胞凋亡是生物界重要的生命现象之一,指的是细胞的程序性死亡,表现为细胞核的皱裂、浓缩和水解[2-4]。在本研究中观察到,脐静脉EC在缺氧复氧的环境下培养后可导致细胞的凋亡,脐静脉EC经Hochest染色后表现出细胞凋亡的典型特征:细胞核出现皱裂、浓缩和水解,从而引起血管内皮结构或功能受损。血管内皮结构或功能受损可导致血管通透性增加,加重心肌水肿,同时也会引起血管舒缩异常,张力增加,使血小板黏附和聚集,形成血栓,进而导致心肌灌注不足,加重缺血再灌注损伤[5-8]。

本研究亦观察到,经高碳酸酸化预处理的EC,其凋亡指数小于缺氧复氧组的EC,30 min HCA组抑制凋亡的效果最大,这表明高碳酸酸化预处理能够通过抑制EC的凋亡来保护细胞。生物体内环境的稳定,不但依赖细胞增殖和分化,也依赖于细胞的凋亡[9-10],凋亡的发生是细胞受促进性和抑制性双向基因共同调节的结果[11-13]。有研究表明KATP通道的抑制剂能够促进EC的凋亡,KATP通道的开放则能够抑制EC的凋亡[14]。KATP通道的开放剂的这一作用与其能够消除缺氧所致的核c-Fos和 c-Jun的表达上调有关[15]。已知高碳酸酸化能够激动KATP通道,因而高碳酸酸化预处理抑制凋亡的机制可能是通过激动KATP通道,上调凋亡促进基因的表达及下降凋亡抑制基因的表达来实现的。

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