59份人脑胶质瘤组织体外培养的药敏分析*

卞 伟,戴勤弼,童建国,阮 健

(重庆市肿瘤研究所神经外科 400030)

脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,因其呈浸润性生长,治疗困难。目前对脑胶质瘤的临床治疗策略仍是在手术切除肿瘤主体的基础上,继续采用多种手段杀灭残存瘤细胞或抑制其增殖[1]。现已明确化疗能延长一些脑胶质瘤患者的生存期,但效果仍不够理想。如今化疗药物种类繁多,选择敏感的化疗药物,对保证化疗的疗效具有重要意义。本研究应用组织培养药敏检测法比较脑胶质瘤5种常用化疗药物的体外抗肿瘤作用。在实施化疗前了解患者病灶对不同化疗药物的敏感和耐受性,旨在为临床筛选化疗药物及制订化疗方案提供参考[2]。

1 临床资料

1.1 一般资料 59份标本均来自2007年1月至2009年1月本科收治的患者,术后病理诊断均为星型胶质细胞瘤。其中男37例,女 22例;年龄24～71岁,平均(41.6±12.0)岁。 按照WHO中枢神经系统肿瘤分类标准:Ⅰ级6例,Ⅱ级13例,Ⅲ级29例,Ⅳ级11例。

1.2 试剂 标本除菌洗涤液为含双抗的无血清RPMI-1640培养液,青霉素和链霉素浓度均为100 u/mL。组织培养液为含10%小牛血清的RPMI-1640培养液。噻唑蓝(M TT)溶液浓度为10 mg/mL,用生理盐水配制,滤膜过滤除菌后装瓶备用,4℃避光保存。化疗药物及相应浓度:洛莫司汀(CCNU)10 μ g/mL、福莫司汀(FCNU)10 μ g/mL、替尼泊甙(VM26)20 μ g/mL、尼莫司汀(ACNU)6.5 μ g/mL 及替莫唑胺(TMZ)7 μ g/mL。所采用的药物浓度均为说明书提示的血浆峰浓度。配药溶剂均使用灭菌注射用水。

1.3 组织培养药敏检测法 本研究采用组织块培养-终点染色-计算机图像分析法(tissue culture-end point staining computer image analysis,TECIA),组织培养采用四孔同步法,以保证组织块的存活及培养成功。本研究中标本系手术中取材,立即送入实验室,保证了标本的新鲜,减少了污染,培养成功率大于80%,即四孔培养基中平均有3孔以上存活。依据梁永钜等[3]报道的方法,用 TECIA分析软件计算化疗药物抑制率(IR)。化疗药物敏感性以抑制率作为评价标准。参照Singh等[4]的研究,抑制率在 30%以上为敏感,低于30%为耐药。

1.4 统计学处理 应用SPSS11.5 for Windows统计软件。脑胶质瘤标本对各种药物敏感性的比较,性别、年龄、病理分级与各种药物敏感性的相关性分析均采用χ2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 化疗药物敏感性的比较 ACNU最敏感,为(43.3±10.6)%;其次是 VM26,为(42.5±7.4)%;CCNU 为(34.6±16.2)%;FCNU为(31.1±8.3)%;TMZ的敏感性最低,为(29.2±15.3)%。ACNU和VM26与其它各组药物敏感性差异有统计学意义(χ2=12.045,P＜0.05),明显优于其他3种单药;进一步两两比较,ACNU敏感性与VM26敏感性差异无统计学意义,CCNU、FCNU和TMZ之间的敏感性差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 性别、年龄和病理类型与各种药物敏感性的关系 CCNU和FCNU的药物敏感性与性别有一定相关性,差异有统计学意义(P＜0.05),而其余各药差异无统计学意义(P＞0.05)。将59例患者分为小于或等于40岁和大于40岁两组,与各种药物的敏感性进行比较,统计结果显示:各组药物的敏感性与年龄之间差异无统计学意义(P＞0.05)。依据WHO胶质瘤分类标准,对肿瘤恶性程度进行分级,按病理类型分为小于或等于Ⅱ级与大于Ⅱ级两组,并与各种药物的敏感性进行比较,经χ2检验,各组药物的敏感性与病理分级差异无统计学意义(P＞0.05),见表 1。

表1 性别、年龄和病理类型与各种药物敏感性的关系(n)

3 讨 论

在化疗前进行体外肿瘤化疗药物敏感性试验来筛选最有效的化疗药物,对于提高肿瘤治疗效果、减轻因盲目应用抗肿瘤药物不良反应均具有重要意义。目前,在进行体外药敏试验时,大多是在细胞系上进行的,但是,细胞系的组织学特性与活体肿瘤细胞有一定差异。

由于在本院进行的脑胶质瘤化疗是采用经股动脉介入行选择性颈内动脉或椎动脉灌注,一般为单药化疗,因此选用一种治疗效果比较好的抗肿瘤药物显得尤为重要。本研究所选的5种药物均为目前临床上治疗恶性脑肿瘤常用的化疗药物。

ACNU为亚硝基脲类药物,具有烷基化作用,能使DNA低分子化,抑制DNA和RNA的合成,从而发挥抗肿瘤作用,并可透过血脑屏障[5]。VM26为鬼臼毒素衍生物,属于拓扑异构酶抑制剂,为周期特异性细胞毒药物,抑制拓扑异构酶Ⅱ,引起DNA断裂,阻断有丝分裂于细胞周期S期和G2期。CCNU为细胞周期非特异性药物,对处于G1～S期边界,或 S期早期的细胞最敏感,对G2期也有抑制作用。进入体内后其分子从氨甲酰胺键处断裂为两部分,一为氯乙胺部分,发挥烃化作用,使DNA链断裂,RNA及蛋白质受到烃化,这与抗肿瘤作用有关;另一部分为氨甲酰基部分发挥氨甲酰化作用,主要与蛋白质特别是其中的赖氨酸末端的氨基等反应,这主要与骨髓毒性作用有关,氨甲酰化还破坏一些酶蛋白使DNA被破坏后难以修复,这有助于抗癌。该药与烷化剂无交叉耐药[6]。TMZ为咪唑并四嗪类具有抗肿瘤活性的烷化剂。在体循环生理pH状态下,迅速转化为活性产物3-甲基-(三嗪-1-)咪唑-4-甲酰胺(M TIC)。MTIC的细胞毒作用主要表现为DNA分子上鸟嘌呤第6位氧原子上的烷基化以及第7位氮原子的烷基化。通过烷基化加成反应的错配修复,发挥细胞毒作用[7]。FCNU为亚硝基脲类中的抑制细胞增殖的抗肿瘤药物,具有烷基化和氨甲酰化活性,及实验性的广谱抗肿瘤活性。其化学结构式含有一个丙氨酸的生物电子等配体(氨基-1-乙基磷酸),使其容易穿透细胞及通过血脑屏障[8]。本研究结果显示:ACNU的敏感率最高(43.3%),其次是VM26(42.5%),两者敏感性无显著差异,但明显优于其他3种药物CCNU(34.6%)、FCNU(31.1%)和TMZ(29.2%)。

离体组织培养法(histoculture drug response assay,HDRA)是一种基于非分散性组织的药敏检测技术,该技术将微小的组织块培养于海绵状胶原凝胶基质上,同时加入抗癌药物作用一定时间,细胞活性终点评价采用MT T还原法。由于单细胞的体外生存环境与体内实体瘤中的环境差别很大,组织培养法与单细胞法相比,能够保持实体瘤在体内的三维生长方式、组织结构、细胞异质性和致瘤性等多种特性,并能模拟体内实体瘤细胞的环境,提高药敏检测的准确性,是一种较实用的微量化体外药敏检测方法,具有很好的临床应用前景。有研究证明,该药敏检测法的结果和临床效果的相关率达到92.1%[9]。本研究基于上述HDRA法原理采用的组织培养药敏检测法,应用图像分析技术,检测了59份脑胶质瘤标本的化疗药物敏感性,发现不同个体对同一药物及同一个体对不同药物的敏感性差异较大,抑制率最高达53.9%,最低为13.9%。

目前临床上脑胶质瘤的化疗方法多为经验性化疗,主要依据患者的临床情况及文献报道。本研究进一步对可能影响药敏检测结果的患者临床因素,如性别、年龄、病理分级进行了相关性分析,未发现药物的敏感性与年龄有关,FCNU和CCNU的敏感性与性别有关.其他药物的敏感性与年龄、性别、病理分级无明显相关。全世界12个恶性脑胶质瘤化疗的随机对照研究(3 004例患者)发现脑胶质瘤的化疗效果与年龄、性别、组织类型、机能状态和手术切除范围均无相关性[10]。因此,临床上为脑胶质瘤患者制订个体化的化疗方案时需要了解患者对化疗药物敏感或耐受的客观指标。肿瘤的体外药敏试验已有数十年的历史,大量研究表明,体外药敏检测与临床疗效存在良好相关性,一般化疗药物的体外敏感与体内有效的符合率为50%～70%,体外耐药与体内无效的符合率为 85%～95%[11]。

由于药物在体外与体内的作用条件不同,体外试验不能完全模拟体内作用的复杂过程,体外药敏检测为敏感的药物,在体内并不一定有效。但如果药物在体外不能抑制肿瘤组织生长,其在体内的作用效果必然不理想。根据本研究的结果可以认为ACNU是目前单药化疗方案中最有效的抗肿瘤药物。

随着对脑胶质瘤分子病理学特征及其耐药机制的逐步认识,根据体外药敏的检测结果和耐药相关基因的表达情况,对于将来指导临床脑胶质瘤的个体化治疗具有重要价值。

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