VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达*

张从纪,杨彦春,单佑安

(第三军医大学西南医院口腔科,重庆400038)

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有向其他细胞分化的巨大潜能。多种生物组织工程和创伤修复研究结果充分展示了MSCs作为种子细胞在创伤愈合过程中的潜在应用前景[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是主要的促进创伤愈合的因子[2],本研究将VEGF DNA转染到MSCs中,增强其在MSCs中的表达,进一步促使MSCs分化为成熟血管内皮细胞以加速创伤愈合过程,为创伤的救治提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂pcDNA3.0-VEGF165质粒、携带GFP标记基因的pTrack-CM V转移载体、pAdEasy-1腺病毒载体、菌株DH5α由单佑安博士惠赠。主要试剂:PacⅠ、PmeⅠ 、BgⅢ 、SaⅡ 、XhoⅠ 、EcroⅤ(Takara公司),T4 DNA 连接酶、Taq DNA聚合酶(上海申能博彩生物技术有限公司),Lipofectamine Reagent(Invitrogen公司),ELISA检测试剂盒(晶美公司),MM LV反转录酶,λ-HindⅢ digest DNA marker(MBI公司),RNA抽提试剂盒(上海Sangon公司)等。

1.2 MSCs的分离与纯化 无菌条件下采集骨髓3mL,用1∶50肝素抗凝,加入等量PBS液洗涤离心(1 000×g离心5min),弃上清液。加入PBS液4mL制备细胞悬液,缓慢加入等量的Percoll分离液(1.073g/L)1 800×g离心20min,收集白膜层的单个核细胞,用PBS液洗涤(1 000×g离心5min)2次,弃上清液,重新悬于含有10%PBS的DM EM/F12培养液中,按105～106/mL的密度接种于25cm2塑料培养瓶中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的孵育箱内培养。24h内首次全量换液,其后每3～4天半量换液,至细胞汇合成单层后进行胰酶消化传代,选取第3代细胞进行鉴定,鉴定选用CD29、CD34、CD44、CD45。

1.3 VEGF基因腺病毒表达载体的构建

1.3.1 重组转移质粒pTrack-CMV-VEGF165的构建 根据VEGF165序列设计合成上下游引物,VEGF正义链5′-TTGCTGCTCTACCTCCAC-3′, 反 义 链 5′-AATGCTT TCTCCGCTCTG-3′,长度为487bp。以本科室原有的经测序正确的pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板,用上述引物进行PCR扩增,获得的PCR产物经琼脂糖电泳鉴定。将纯化的PCR产物和质粒pTrack-CMV分别经 XhoⅠ、EcroⅤ双酶切后,用胶回收试剂盒回收目的片段,用T4 DNA连接酶连接过夜,氯化钙法转化DH5α感受态菌,挑取后单克隆,PCR扩增,双酶切后测序鉴定。

1.3.2 重组腺病毒载体的构建 将测序正确的pTrack-CM V-VEGF165基因重组质粒和空载体质粒用PmeⅠ单酶切线性化,胶回收与pAdEasy-1腺病毒载体用氯化钙法共转化BJ5183感受态,酶切后鉴定阳性克隆,获得重组腺病毒载体,转化DH5α感受态菌,大量扩增阳性克隆。

1.3.3 重组腺病毒的包装及扩增 按质粒抽提试剂盒说明书操作提取重组腺病毒质粒和空载体质粒,经PacⅠ线性化后,按Lipofectamine Reagent操作说明书转染293细胞,增养3～5d后,在荧光显微镜下观察GFP荧光,7～10d收集细胞,-70℃、37℃反复冻融,离心收集上清液,获取初毒,同法进行大量扩增,氯化铯纯化病毒。倍比稀释法检测病毒滴度,本实验的病毒滴度为2.45×1010PFU/mL。

1.4 VEGF转染体外扩增的MSCs

1.4.1 Ad-VEGF165转染体外扩增的MSCs 取3～6代MSCs按 1×105/孔的密度接种于24孔板中,培养24h后吸出培养液,加入用上述培养液作系列稀释的Ad-VEGF165,1×103(b)、1×105(c)、1×106(d)、1×107(e)、1×108(f)、1×109(g)、1×1010(h)PFU/mL,每个滴度加入 4孔,另设 4孔作为未加入病毒的空白对照(a),继续培养48h,定期观察转染率。

1.4.2 MSCs增殖的检测 采用CCK-8法检测细胞增殖,将MSCs按5×103/200μ L接种 96孔板。分为不同滴度病毒转染组和空白对照组,24h后,每孔加入 10μ L CCK-8,继续培养4h,用WellScan MK22型酶标仪450nm波长测定每个孔的吸光度值(A),连续检测7d。绘制生长曲线,同时观察细胞形态变化。

1.4.3 MSCs中VEGF mRNA含量的检测[3]采用RT-PCR法,分别于转基因后 24、48、72h 和 5、7、10、14d 按照 RNA 提取试剂盒说明书提取MSCs总RNA,VEGF引物如前所述;内参照β-肌动 蛋 白(β-actin)5′端 引物 序 列 为 5′-AAGGTGACCCAGAT-CATGTT TGAG-3′,3′端引物序列为 5′-AGGAGGAGCAATGATCTTGATCTT-3′,DNA 长度为 289bp。采用RT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应。反应结束后取8μ L PCR产物经1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳后,用溴化乙啶染色,电泳完毕后在紫外灯下观察照相,密度扫描分析PCR产物带。将VEGF与β-actin比值作为 VEGF表达水平的参数,对VEGF PCR产物相对定量。

2 结 果

2.1 pTrack-CMV-VEGF165重组转移质粒及重组腺病毒载体的构建 以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板进行PCR,能扩增出VEGF165目的片段,重组载体pTrack-CMV-VEGF165 PCR扩增后,经XhoⅠ、EcroⅤ双酶切后同样能释放出 487bp大小的片段,表明VEGF165的基因已成功亚克隆于pTrack-CM V转移质粒中(图1)。DNA序列测定进一步证实成功构建了pTrack-CMV-VEGF165重组转移质粒。基因VEGF165成功克隆至腺病毒穿梭载体pTrack-CMV中,pTrack-CMVVEGF165重组转移质粒与骨架DNA在细菌BJ5183中成功重组出腺病毒pAd-VEGF165,重组的腺病毒质粒经PacⅠ酶切后出现一大一小2个片段,大片段约23kb,小片段约4.0kb,与预期的谱形相同,证实重组腺病毒成功(图2)。

图1 pTrack-CMV-VEGF165重组转移质粒鉴定电泳图

2.2 分离、培养MSCs细胞 骨髓细胞培养4h贴壁,形态均一,呈长梭形,贴壁细胞增殖迅速,10～14d后接近融合呈成纤维状形态(图3)。表面标志CD34、CD35阴性表达,而 CD29、CD44阳性表达,说明所培养的细胞非造血干细胞。

图2 重组腺病毒pAd-VEGF165经PacⅠ酶切电泳图

图3 第3代MSCs形态(倒置相差显微镜,×20)

2.3 转染VEGF165后MSCs增殖及形态变化 MSCs转染pAd-VEGF165后每天在荧光显微镜下观察各滴度的荧光表达,激发波长为488nm、发射波长为507nm,转染率=暗视野所见发绿色荧光的细胞数/明视野所见细胞数。转染后24h可见荧光,7d时荧光表达最强,其不同病毒滴度的转染率:1×103PFU/mL为0、1×105PFU/mL为12%、1×106PFU/mL为34%、1×107PFU/mL为56%、1×108PFU/mL为 78%、1×109PFU/mL为85%、1×1010PFU/mL为85%。

腺病毒载体转染后MSCs细胞仍贴壁生长,呈梭形或多角形,有分裂增殖,但速度有所降低。荧光显微镜下,24h可见细胞有绿色荧光表达,但强度较低,48h可见细胞有强烈荧光表现,呈全细胞分布,7d荧光表达最强。CCK-8结果提示:a、b、c 3个组间差异无统计学意义(P＞0.05),其余组与a组相比差异有统计学意义(P＜0.01),说明病毒滴度在105PFU/mL以下时,对细胞活力无明显影响,滴度大于106PFU/mL时,开始对细胞增殖产生抑制,而且随剂量增加,抑制作用越明显,从细胞生长曲线还可以看出,4d后病毒对d、e、f、g组细胞增殖能力的抑制渐弱,而 h组细胞8d时抑制作用仍明显(图4)。

2.4 转VEGF基因后MSCs中VEGF的水平变化 提取标本总RNA,经紫外分光光度计检测A260/A280值为1.8～2.0,证明无蛋白质污染。提取RNA总浓度为0.5～2.0g/L。由于β-actin几乎存在于所有细胞中,并且含量相对稳定,VEGF的基因表达程度以VEGF mRNA相对于β-actin mRNA取得。由图5可见,转基因后于48～72h达到表达高峰。

图4 各组细胞的生长曲线

图5 不同时间段MSCs中VEGF mRNA/β-actin mRNA值变化情况

3 讨 论

MSCs具有向其他细胞分化的巨大潜能,近年来其分化潜能不断被发现,已彻底打破了固有的认识。中胚层起源的MSCs不但可分化为骨骼、肌肉等中胚层组织,也可以跨胚层分化为外胚层的神经元和上皮组织,还可分化为内胚层的心肌细胞、肝细胞和肾小管上皮细胞[3-5]。在创伤条件下,MSCs能分化成血管内皮细胞及表皮细胞参与创伤的修复过程,因此在生物组织工程和创伤修复的研究中MSCs占据了重要位置。可以设想,如果能调控MSCs转化为血管母细胞,继而分化为成熟血管内皮细胞,将有效地加速创伤的愈合过程,为创伤的救治提供新的方法。

机体损伤后出现协调的愈合过程,其中包括多种细胞、细胞因子和细胞外基质之间错综复杂的网络作用。细胞因子在创伤愈合过程中具有重要作用,它能调节创伤修复过程中的多种细胞反应,影响细胞增殖、迁移、细胞外基质合成和释放等[6-7]。在众多细胞因子中,VEGF在血管的再生过程中起着重要的作用,无论是在伤前组织还是伤后不同修复阶段的组织中,VEGF均呈持续性阳性表达,它通过促进血管内皮细胞的有丝分裂、血管通透性的增加以及协助释放其他生长因子等方式促进局部血管的再生,被公认为首选的促血管生长因子[8-10]。

本实验使用构建的带有VEGF165的重组腺病毒感染培养的MSCs,滴度为1×107PFU/mL时可获得56%的感染率,且转染率随病毒滴度的增加而有所增加,1×109PFU/mL是转染的最佳滴度,超过此滴度不能提高其转染率,并且对细胞的毒性作用明显。对转染细胞增殖活性的生长曲线分析说明,滴度在1×105PFU/mL以下对细胞增殖无明显影响,随着滴度增加,对细胞的增殖有所影响,主要表现在转染病毒的早期,持续约4d左右,之后细胞的增殖能力渐恢复。病毒滴度在1×1010PFU/mL时,对细胞的增殖影响最为明显。表明病毒滴度在1×106～1×109PFU/mL时,可以高效转染,并对细胞增殖影响较小,对后续研究无明显影响。

本实验结果显示,MSCs在转染VEGF之后24h即检测到基因表达,至72h达表达高峰,之后逐渐下调并维持2周左右时间。说明外源性的VEGF已成功转染到目的细胞体内,并得以正常表达。虽然其表达为2周左右时间,但在促进创伤愈合方面可能会起到促进作用,因一般创面愈合时间为1周左右。

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