柔肝消饮对肝硬化大鼠血清Leptin含量以及肝脏Leptin mRNA表达的影响＊

杨牧祥 张一昕 于文涛 徐华洲 高 玮 韩 雪

河北医科大学中医学院(石家庄050091)

1 材料

1.1 实验动物清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量

180～200g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，动物合格证号:SCXK(鄂)2004-007。

1.2 药物柔肝消饮组成:由香附、青皮、炙黄芪、炒白术、白芍、三棱、莪术、地鳖虫、郁金、姜黄、丹参等药物组成，水煎浓缩成所需浓度的药液。复方鳖甲软肝片:由内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产，批号国药准字Z19991011，实验时用蒸馏水配制成所需浓度的药液。

1.3 主要试剂Leptin试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司;Trizol RNA试剂盒购自美国Invitrogen公司;PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司。Leptin的引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成，以β-actin为内参照。Leptin的上游引物为5'-CCTGTGGCTTTGGTCCTATCTG-3';下游引物为5'-CTGCTCAGAGCCACCACCTCTG-3'，扩增片段为420bp。β-actin上游引物为5'-CCA AGGCCA ACCGCGAGA AGATGA C-3'，下游引物为5'-AGGGTACATGGTGGT GGCGCCAGAC-3'，扩增片断长度为577bp。

1.4 主要仪器756MC型紫外-可见分光光度计、PE9600型PCR扩增仪、电泳仪及电泳槽、凝胶图像分析系统、紫外透射仪、超低温保存箱、高速冷冻离心机等。

2 方法

2.1 模型制备60只大鼠适应性喂养1周后，随机分为造模组48只和正常组12只。参照文献［5-6］，48只造模组大鼠首次予皮下注射40%CCl4花生油溶液(0.5mL/100g体质量)，以后每周2次皮下注射(0.3mL/100g体质量)，共9周。造模开始前2周均以20%猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料(由河北医科大学动物实验中心加工)喂养，第3～9周以0.5%胆固醇和99.5%玉米面混合饲料(由河北医科大学动物实验中心加工)喂养。整个造模期间以30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常组则以正常饲料和纯净水喂养。实验第9周末，确认造模成功后予以分组治疗。

2.2 分组与治疗造模成功后，正常组随机抽取大鼠10只，将造模成功大鼠随机抽取40只，并分为4组，每组10只，雌雄各半。即:正常组，灌服生理盐水;模型组，灌服生理盐水;柔肝消

2.3 动物取材治疗4周末，于最后1次给药后禁食12h，麻醉状态下腹主动脉取血，3500r/min离心5min，分离血清待检。同时切开腹部迅速剖取肝脏，一部分液氮冷冻，一部分用4%多聚甲醛固定。

2.4 指标检测

2.4.1 肝组织病理形态学观察取用4%多聚甲醛固定的大鼠肝组织，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。

2.4.2 血清Leptin的检测采用放免法，严格按照试剂盒说明操作。

2.4.3 RT-PCR法测定大鼠肝LeptinmRNA表达 (1)采用Trizol提取总RNA，然后测定RNA样品含量及纯度:A260/A280=1.8～2.0间方可使用。(2)RT反应:取总 RNA 2μg，加入RT 反应体系(含 AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Primer，AMV，Rnase Inhibitor等)管中，并用DEPC处理水补足到50μL反应液体积，震荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于PCR仪50℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。-20℃保存备用。(3)PCR反应:50μL反应体系含Taq DNA聚合酶、dNTPs、上样染料、稳定剂、优化剂、反应缓冲液、逆转录反应产物、上下游引物等。震荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于PCR仪扩增。反应条件:变性94℃，30s，退火 61℃，30s，延伸 72℃，30s，30 个循环，最后延伸 10min。(4)半定量分析:取每个标本的扩增产物6μL于1%的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker(DL2000)作为标准分子量标记，电泳后于紫外透射仪观察，并用数码相机照相，输入微机应用法国VL公司BIO-PROFIF凝胶图像分析系统对目的电泳条带进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。

2.5 统计学处理数据以(±s)表示，运用SPSS 11.5统计软件，采用方差分析、Student-Newman-Keul检验。

3 结果

3.1 肝组织病理形态学改变正常组大鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞排列规则成索状，在中央静脉周围呈放射状分布。肝血窦结构清晰，无异常改变。肝细胞呈多边形，胞浆均匀，细胞核形态正常。模型组大鼠肝小叶正常结构消失，间质内弥漫性淋巴细胞浸润。肝细胞体积明显增大，局部肝细胞出现严重的脂肪变性，可见到再生的肝细胞(双核)。肝间质广泛纤维组织增生，将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成)。高剂量组大鼠肝小叶结构轻度受损，少数肝细胞气泡样变性，偶见坏死细胞，较少炎性细胞浸润，少量纤维组织增生，但未见形成间隔。低剂量组肝小叶结构被破坏，部分肝细胞气泡样变性并伴有细胞坏死，较多淋巴、单核细胞浸润，纤维组织增生，但较少形成间隔。阳性药对照组与低剂量组基本相似。

见表1。与正常组相比，模型组大鼠血清Leptin的含量异常升高 (P＜0.01)，给药后，各治疗组均能显著降低血清Leptin的含量(P＜0.01)，且柔肝消饮高剂量组Leptin的含量低于低剂量组和对照组(P＜0.01)，而柔肝消饮低剂量组与阳性药对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

见表1、图1、图2。RT-PCR后，琼脂糖凝胶电泳，在420bp、577bp处分别显示出Leptin和β-actin电泳带，与预期结果一致。模型组大鼠Leptin mRNA的表达显著高于正常组 (P＜0.01)。给药后，各治疗组Leptin mRNA的表达显著低于模型组(P ＜0.01)，柔肝消饮高剂量组Leptin mRNA的表达低于柔肝消饮低剂量组和阳性药对照组(P＜0.05)，而柔肝消饮低剂量组与阳性药对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清Leptin含量和肝组织Leptin mRNA的表达情况(±s)

表1 各组大鼠血清Leptin含量和肝组织Leptin mRNA的表达情况(±s)

与模型组比较，＊P＜0.01;与阳性药对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与柔肝消饮高剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

组别正常组模型组柔肝消n饮高剂量组柔肝消饮低剂量组阳性药对照组10 10 10 10 10 Leptin(ng/mL)0.54±0.09＊2.08±0.29 0.99±0.14＊△△1.38±0.25＊▲▲1.52±0.19＊Leptin/β-actin mRNA 0.285±0.023＊1.212±0.109 0.649±0.594＊△0.818±0.123＊▲0.857±0.114＊

图1

图2

4 讨论

Leptin是由肥胖基因编码的一种多肽类激素，除全身的脂肪组织外，肝脏、胃黏膜、胎盘、胎儿心脏、骨骼肌、骨及软骨组织等均可以分泌Leptin［7］。Letin受体分布广泛，是一种多靶器官、多功能的激素，具有广泛的生物学效应，它参与糖、脂肪及能量代谢的调节，促使机体摄食减少，增加能量释放，抑制脂肪细胞的合成，抑制胰岛素的分泌［8］。自 Potter等［9］发现活化的肝星状细胞(HSCs)中Leptin mRNA和蛋白质合成增加之后，Leptin与肝脏疾病的关系逐渐引起重视。大量动物实验证明，瘦素可通过调节HSC对细胞因子及胶原的表达促进肝纤维化进程［10］。Bolukbas等［11］发现进展期肝病患者的血清Leptin水平明显升高。近年来研究显示:慢性肝病时激活的HSCs产生Leptin，Leptin又进一步促进HSCs的增殖与活化，导致Letin水平明显升高。Leptin通过与库普弗细胞、SECs上的瘦素受体结合，提高库普弗细胞、肝窦内皮细胞中细胞因子TGF-β1的表达，导致胶原的大量产生及肝硬化的形成［4］。

肝硬化根据临床表现可归属于中医学“胁痛”、“积聚”、“臌胀”等范畴。中医学认为本病多由酒食不节，损伤脾胃，脾失健运，壅阻气机，肝失条达，气血郁滞，或情志抑郁，肝失疏泄，气郁日久，血流不畅，瘀血停积，胁络痹阻所致。其病位在肝脾两脏，主要病机为肝郁脾虚、气滞血瘀。故当以疏肝健脾，行气活血，逐瘀消为主要治法。课题组经多年临床观察，精心筛选相关药物组成“柔肝消饮”。方中香附、青皮疏肝理气，炙黄芪、炒白术健脾益气，四药相合，共达抑肝扶脾之效;炙黄芪、炒白术益气健脾;三棱、莪术、地鳖虫、丹参、郁金、姜黄破血行气，逐瘀消;白芍养血柔肝，既可助香附、青皮疏肝解郁之力，又可防止破血太过之弊;诸药合用，共奏疏肝健脾，行气活血，逐瘀消之功效。

本实验研究表明，模型组大鼠血清Leptin含量异常升高，肝脏Leptin mRNA表达明显增强(P＜0.01)，显示肝硬化的发生与发展与Leptin的分泌与释放有密切关系。经过治疗，各治疗组大鼠血清Leptin含量明显降低，肝脏Leptin表达减弱，说明柔肝消饮通过抑制HSCs分泌Leptin，以达到抗肝硬化的作用，这可能是其治疗肝硬化的分子机制之一。

［1］杨牧祥，张一昕，王少贤，等.柔肝消饮对肝硬化大鼠肝功能的影响［J］. 中医药通报，2007，6(3):58-59.

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