产ESBLs和AmpC酶阴沟肠杆菌的检出率及耐药性监测

邵良荣,邵 杰,居会祥,孙明中,陈思聪

(1.东南大学医学院附属盐城医院,江苏盐城224001;2.南京中医药大学第一临床医学院,江苏南京210046)

对超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的研究虽已有二十多年历史,但由于它们作用底物广、易播散、数量种类不断增加、个体差异大,对临床治疗造成很大威胁,使得对这些酶的研究持续至今天。近年来,ESBLs更是在几乎所有肠杆菌科细菌及以外细菌中都有检出。阴沟肠杆菌亦不例外。2001年-2004年我们已对产ESBLs阴沟肠杆菌的临床分布、及耐药情况进行了研究[1]。鉴于此,我们又对2005-2007年中所收集的阴沟肠杆菌中ESBLs检出率及耐药状况进行进一步研究,同时对产AmpC酶的阴沟肠杆菌的检出率及耐药状况进行研究,希望能更全面的了解目前产ESBLs阴沟肠杆菌状况。

1 材料与方法

1.1实验用菌株为2005-2007年本院收集的阴沟肠杆菌。质控菌:大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC700603。产AmpC酶的阴沟肠杆菌EB131标准菌由有关公司惠赠。

1.2实验药品阿莫西林、棒酸、头孢克洛、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、舒巴坦、头孢托仑、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星、莫西沙星、头孢他啶纸片、头孢他啶/棒酸纸片、头孢噻肟纸片、头孢噻肟/棒酸纸片、头孢西丁纸片、头孢曲松纸片、头孢西丁/APB,头孢噻肟/APB、头孢泊肟、头孢泊肟/棒酸、。以上纸片均为Oxoid公司产品。

1.3致病菌鉴定实验所用菌株均经API鉴定系统复核鉴定。

1.4阴沟肠杆菌产ESBLs和AmpC酶的检测

1.4.1AmpC酶检测

1.4.1.1APB酶抑制剂增强试验[2]将浊度为0.5 MacFarland的受试菌菌液接种于Mueller-Hinton琼脂平面,将头孢噻肟,头孢他啶,头孢西丁,头孢噻/APB,头孢他啶/APB,头孢西丁/APB纸片分别贴于Mueller-Hinton平皿上,37℃培养16-18 h后观察结果。头孢他啶/APB-头孢他啶,头孢噻肟/APB-头孢噻肟,头孢西丁/APB-头孢西丁抑菌圈直径相差大于或等于5 mm判定为酶抑制剂增强试验阳性,即细菌产AmpC酶。

1.4.1.2AmpC酶的诱导试验[3]将浊度为0.5 Mac Farland的受试菌菌液接种于Mueller-Hin-ton琼脂平面,作为诱导剂的IPM纸片贴于Mueller-Hinton平皿中央,作为指示剂的头孢吡肟,头孢噻肟,头孢噻肟/棒酸,头孢他啶/棒酸纸片贴于IPM纸片周围,各指示剂纸片与IPM纸片中心相距25 mm,37℃培养16-18 h后观察结果,任一指示剂纸片近IPM一侧出现抑菌环被切割的现象,判断为阳性,即该菌株为诱导型产AmpC酶菌株。

1.4.1.3去阻遏型AmpC酶检测 参照Park YJ等人文献[4]操作,即按CLSI推荐的K-B法进行头孢他啶,头孢噻肟,头孢西丁的药敏试验,三种药全耐药判定为细菌产去阻遏型AmpC酶。

1.4.1.4DHA型AmpC酶编码基因的PCR扩增PCR扩增引物和反应条件参照文献[5]。

1.4.2ESBLs的检测 双纸片增效法(DDS)试验:用M-H琼脂平板(Oxoid英国)以及含和不含棒酸(10 μ g)的头孢噻肟(30 μ g)或头孢他啶(30 μ g);含和不含棒酸(1 μ g)的头孢泊肟(10 μ g)药敏纸片(Oxoid英国)。对于头孢噻肟、头孢他啶如果含棒酸和不含棒酸抑菌区直径相差大于5 mm,对于头孢泊肟含棒酸和不含棒酸抑菌区直径相差大于4 mm,就视为ESBLs阳性[6]。

1.5数据分析采用WHONET25.3软件。按照CLSI/NCCLS2007文年软件M1002S17规定的折点判定耐药(R)、中介(I)和敏感(S)。

2 结果

2.1阴沟肠杆菌体外抗菌试验结果81株阴沟肠杆菌对19种抗菌药物的耐药率见表1。

2.281株阴沟肠杆菌产ESBLs和/或AmpC酶药敏试验结果,将ESBLs和AmpC酶检出率分别与头孢曲松、头孢噻肟和头孢他啶药敏试验联合分析,结果见表2。

表1 81株阴沟肠杆菌对19种抗菌药物的耐药率比较

3 讨论

2001年-2004年我们已对产ESBLs阴沟肠杆菌的临床分布、及耐药情况进行了研究。本次研究的结果表明,ESBLs在阴沟肠杆菌中的检出率达到35.0%,较上次34.6%略高。但对其又作了进一步研究,耐药情况亦作了更进一步的研究。,其中单纯产ESBLs的菌株占到一半(14/28),占整个阴沟肠杆菌的17.3%。在佘丹阳的报告中[7],阴沟肠杆菌ESBLs检出率为23.6%,其中单产ESBLs的比例是10.4%。这一比例高于国外文献报道的2.9%[8],原因有待进一步探询。但可以说,除了AmpC酶,阴沟肠杆菌耐药还有一部分是由于ESBLs所引起。将产酶情况和药敏结合分析发现,单纯产AmpC酶的菌株,对所测第三代头孢菌素有很强的耐药性。既产ESBLs又产AmpC酶的菌株耐药情况较严重。而单产ESBLs的菌株,绝大部分对头孢曲松和头孢噻肟中介;对头孢曲松和头孢噻肟耐药的占40%以上,有一小部分(不到三分之一)对头孢他啶敏感,但敏感率高于头孢曲松和头孢噻肟,估计这与其所产ESBLs类型密切相关。将ESBLs和AmpC酶检出率分别与头孢曲松、头孢噻肟和头孢他啶药敏结果联合分析发现:对头孢曲松中介的14株阴沟肠杆菌中ESBLs的检出率高达92.9%,是AmpC酶检出率的两倍多。但在对头孢曲松耐药的27株菌中,情况刚好相反,AmpC酶的检出率(88.9%)是ESBLs检出率(40.7%)的两倍多。头孢噻肟中介和耐药株中两酶的检出情况与头孢曲松相似。头孢他啶只有1株中介株;敏感株中两酶的检出率略高于头孢曲松和头孢噻肟;耐药株中AmpC酶检出率(78.4%)约是ESBLs检出率(56.8%)的1.4倍。由此可见,在阴沟肠杆菌中,对头孢曲松和头孢噻肟中介的菌株,以产ESBLs为主,耐药菌株以产AmpC酶为主。提示对阴沟肠杆菌中ESBLs的监测研究很有必要。

表2 阴沟肠杆菌部分药敏试验产酶情况(%)

体外抗菌试验结果提示,碳青霉烯类抗生素、第四代头孢菌素头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦对AmpC酶和ESBLs均为稳定的β内酰胺类抗生素,可用于治疗产AmpC酶、ESBLs菌引起的重症感染。但碳青霉烯类抗生素为治疗首选。

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