急性冠脉综合征患者CD4+CD28-T细胞对内皮细胞的溶解作用

黄立娟,宋 辉,孙文杰

(哈尔滨医科大学附属第二医院检验科,黑龙江哈尔滨150086)

急性冠脉综合征(ACS)是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀,继发完全或不完全闭塞性血栓形成的一组临床综合征。近年来在ACS患者的粥样斑块和外周血中发现了CD+CD28-T细胞,并认为CD+CD28-T细胞在ACS患者斑块破裂中可能具有直接的作用。因此研究CD+CD28-T细胞对探讨其在ACS患者斑块破裂中的作用具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象

(1)急性冠脉综合症(ACS)组:临床上选择符合ACS诊断标准的患者30例。根据心绞痛发作性质、持续时间、程度,以及 CK-MB、TnI检查诊断为不稳定心绞痛或急性心肌梗死。所有患者均行冠状动脉造影检查证实有冠状动脉疾病。(2)稳定型心绞痛(SAP)组:选择有典型的劳累性胸痛,休息或含服硝酸甘油后缓解的患者30例,所有患者至少一个主要冠状动脉50%以上的狭窄,且没有全身性炎症或心肌炎症。(3)正常对照组:健康体检者20例,无冠状动脉疾病病史,并经常规心电图及实验室检查确认无心脑血管等疾病。

1.2 实验方法

1.2.1主要试剂和设备 FITC-CD28 mAb,PerCPCD3 mAb,PE-CD4 mAb,PE-CD28 mAb,PerCP-CD4 mAb和PHA-P(美国Biolegend公司),FITC-anti-human CD161 mAb(美国Ancell公司),CD4 Negative Isolation Kit(Dynal Biotech USA),Postive Selection Human FITC Selection Kit(Empty Roboccp Stemcell),乳酸脱氢酶(LDH)释放法定量检测试剂盒(上海劲马生物技术有限公司)。磁极(Easyse),流式细胞仪(美国BD公司FACSort),酶标仪(美国BD公司)。

1.2.2外周血CD+CD28-T细胞数量测定 实验设实验管和对照管。实验管和对照管分别加入新鲜全血 100 μ l。实验管加入 20 μ l PerC-CD3 mAb,PECD4单抗和FITC-CD28 mAb,对照管加入20 ml同型对照抗体,混匀,室温避光孵育30 min,加入红细胞裂解液,1 000 r/min离心5 min,弃上清。用PBS洗涤,1 000 r/min离心5 min,弃上清,用1%多聚甲醛PBS固定10 min。流式细胞仪分析CD+CD28-T细胞的白分比。

1.2.3外周血CD+CD28-T细胞表达CD161的检测 实验设实验管和对照管。实验管和对照管分别加入新鲜全血 100 μ l,实验管加入 20 μ l PerCP-CD4 mAb,PE-CD28 mAb和FITC-CD161 mAb,对照管加入20μ l同型对照抗体,后面步骤同上。用流式细胞仪分析CD+CD28-和CD4+CD28+细胞CD161的表达。

1.2.4CD+CD28-T细胞克隆表达CD161测定

1.2.4.1分离CD+CD28-T细胞和CD4+CD28+T细胞采静脉血(EDTA抗凝)50 ml,用免疫磁珠分选法分离CD+CD28-T细胞和CD4+CD28+T细胞。按说明书操作。用流式细胞仪对CD+CD28-T和CD4+CD28+T细胞纯度进行鉴定,方法同CD+CD28-T细胞的测定。

1.2.4.2CD+CD28-T和CD4+CD28+T细胞克隆采用有限稀释法将免疫磁珠法分离到的CD+CD28-和CD4+CD28+T细胞分别进行克隆,在克隆好的CD+CD28-和CD+CD28-T细胞悬液加入IL-12,调整培养液的浓度,IL-12终浓度为20 μ/ml,培养48小时。

1.2.4.3CD+CD28-细胞克隆CD161表达的测定具体操作同外周血CD161测定。用流式细胞仪分析CD+CD28-和 CD4+CD28+T细胞刺激前后CD161的表达。

1.2.5CD+CD28-T细胞溶解内皮细胞的功能 用乳酸脱氢酶释放法

1.2.6统计结果处理 用SPSS软件分析,实验数据以均数±标准差来表示,采用两组间资料的t检验分析,P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 急性冠脉综合征患者外周血CD+CD28-T细胞的数量

正常对照组、SAP组和ACS组的CD4+CD28-T细胞的数量见表1。可以看出ACS组CD4+CD28-细胞比例比正常对照组和SAP组显著增加(P＜0.05)。

表1 外周血 CD+CD28-T细胞数量(%,s)

表1 外周血 CD+CD28-T细胞数量(%,s)

注:*与正常对照组,SAP组比较P＜0.01

分组 正常对照组(n=20)SAP组(n=30)ACS组(n=30)CD+CD28-T 1.75±1.55 3.64±1.33 15.55±5.76*

2.2 急性冠脉综合征患者外周血CD+CD28-T细胞表达CD161

实验结果显示,ACS组CD+CD28-T细胞CD161的表达显著高于CD4+CD28+T细胞CD161的表达(图1)。

2.3 IL-12刺激后CD+CD28-T细胞克隆CD161的表达

实验结果显示,未加IL-12刺激细胞克隆后的CD+CD28-和CD4+CD28+细胞都不表达CD161。而用IL-12刺激细胞克隆后,CD+CD28-细胞高表达CD161,CD4+CD28+细胞几乎不表达CD161(图2)。

2.4 CD+CD28-T细胞对内皮细胞的杀伤能力

效靶比为5∶1时,CD+CD28-T细胞对内皮细胞的杀伤活性(43.32±2.32)%显著高于CD4+CD28+T细胞对内皮细胞的杀伤活性(4.98±0.45)%值(P＜0.01)。效靶比为20∶1时,CD+CD28-T细胞对内皮细胞的杀伤活性(51.31±3.12)%显著高于CD4+CD28+T细胞对内皮细胞的杀伤活性(5.01±0.33)%值(P＜0.01)。与CD4+CD28+T细胞相比,CD+CD28-T细胞随着效靶比增高杀伤活性明显增强(P＜0.05)(表2)。

图1 外周血CD+CD28-T细胞表达CD161的情况

图2 CD4+CD28+T细胞和CD+CD28-T细胞克隆CD161的表达

表2 CD+CD28-T对内皮细胞杀伤作用(%,s)

表2 CD+CD28-T对内皮细胞杀伤作用(%,s)

注:*与CD4+CD28+组比较(comparation with CD4+CD28+group)P＜0.01

分组 5∶1 20∶1 CD4+CD28+T组 4.98±0.45 5.01±0.33 CD+CD28-T组 43.32±2.32* 51.31±3.12*

3 讨论

多数研究表明在强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症等自身免疫性疾病中CD+CD28-T细胞显著增高[2-4]。血液淋巴细胞的激活,炎性因子的增多和内皮细胞间的炎性细胞反应造成急性冠脉综合征患者免疫系统的异常,这在ACS的发病机制中起重要作用[5,6]。Chapman等[7]对CD+CD28-淋巴细胞特性进行了研究,发现在缺乏CD28信号时,能被抗CD3单抗激活并产生高水平的炎性细胞因子IL-2和 IFN-γ,提示CD+CD28-T淋巴细胞是一种促炎性反应细胞。本研究发现,CD+CD28-T淋巴细胞在急性冠脉综合征患者外周血中异常增多,提示ACS的发生发展可能与CD+CD28-T淋巴细胞亚群的作用密切相关。

本研究结果显示外周血CD+CD28-T细胞显著高于正常对照组和稳定性心绞痛组。同时检测了CD+CD28-T细胞是否表达CD161。研究结果表明,CD161在ACS患者外周血CD+CD28-T细胞上的表达显著高于在CD4+CD28+T细胞上的表达。这说明缺失了CD28分子的CD4+T细胞获得了另一种新的表达,具有同NK细胞相同的表面标志。而未用IL-12刺激细胞克隆的 CD+CD28-T细胞不表达CD161,用IL-12刺激细胞克隆后的CD+CD28-T细胞高表达CD161。这种现象说明在ACS患者体内的CD+CD28-T细胞是受某种因素刺激而获得了CD161的表达,使得该细胞在体内处于活化状态。

用CD4+CD28+T细胞和处于活化状态的CD+CD28-T细胞分别与脐静脉内皮细胞共培养,检测两种细胞对内皮细胞的溶解能力。结果表明,CD+CD28-T对内皮细胞有很高的溶解作用,显示出很强的细胞毒功能,而CD4+CD28+T细胞没有这种功能。在增加效靶比后,CD+CD28-T细胞溶解内皮细胞的作用增强,而CD4+CD28+T细胞的作用无变化,这说明内皮细胞的损伤程度与CD+CD28-T细胞浓度有关。因此,ACS患者体内异常的CD+CD28-T细胞增高以及增高的程度可能与疾病的严重性有关。

综上所述,CD+CD28-T细胞可能通过不同途径对内皮细胞产生杀伤作用。本研究证实了急性冠脉综合征患者增多的CD+CD28-T细胞在体内处于活化状态,具有细胞毒活性,这种细胞毒活性对血管内皮细胞有溶解作用,从而导致粥样斑块下内皮糜烂,引起斑块破裂,造成急性事件的发生。这一研究为临床在治疗和预防ACS提供了新的思路,具有十分重要的意义。

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