人成骨肉瘤细胞系MG-63“Holoclone”样单克隆的分离及其成骨分化程度的鉴定

孙树东,娄 楠,王 岩,赵建武

(1.吉林大学第二医院骨科,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院骨科;3.吉林大学中日联谊医院基因诊疗中心)

骨肉瘤无论从临床角度还是分子生物学角度来讲都是一个异质性的肿瘤,而其一直就采用间充质的分化标准来进行分级。尽管目前在医学研究和外科手术上都取得了长足的进步,但对于高危骨肉瘤的死亡率仍然停滞在30%到50%,而如何针对其近年来已有学者通过骨肉瘤的研究,使用单细胞克隆筛选的方法,以图得到高侵袭,高致瘤的细胞亚群。而我们采用先分离得到holoclone后通过多个成骨细胞分化标志物的检测,得到高侵袭及高致瘤的骨肉瘤细胞株。并对这些骨肉瘤细胞株进行了一系列的鉴定试验。而通过观察我们发现能够形成“holoclone”的恶性肿瘤细胞是肿瘤中的真正致瘤部分,而这些细胞株形成的克隆更小,具有很高的克隆形成能力和更强的粘附能力[1,2]。其成骨分化标志物表达更趋近于未分化状态。

1 材料和方法

1.1 材料

人成骨肉瘤细胞MG-63购自ATCC。高糖DMEM(H-DMEM)Gibico USA优等胎牛血清(FBS)Hyclone USA胰酶Promega USA DMSO天佳生物科技有限公司China DEPC鼎国生物科技有限公司China Trizol InvitrogenUSA TaKaRa RT-PCRKit TaKaRa Japan Marker 1500 Takara Japan Taq DNA聚合酶TAKARA Japan CCk-8碧云天生物研究所CHINA

1.2 克隆筛选

采用有限稀释法,将对数生长期的骨肉瘤MG-63细胞在96孔板中稀释成每孔含0.5-1个细胞,在克隆化后3-5 d选出仅含有单个细胞生长的并生长成完全克隆的孔进行标记,待细胞增殖至孔面积1/3时(即细胞数超过600个),将细胞移至24或48孔板中扩大培养,后再转至6孔板,最后转入培养瓶,后行细胞功能实验鉴定。

1.3 生物学特性鉴定

1.3.1形态学 相差显微镜拍摄有限稀释法分离得到的各单克隆细胞亚系的细胞形态。

1.3.2细胞增殖率测定 用96孔板接种细胞数为103/孔,连续计数 7 d,绘制生长曲线。采用Cell Counting Kit-8(CCK8)分析骨肉瘤细胞增殖。每组取6个复孔,将培养板移入CO2孵箱中,在37℃,5%CO2及95%湿度条件下,培养24 h。每孔加CCK-8试剂10 μ l,放入CO2孵箱中孵育2 h,酶标仪波长450 nm,读取光密度OD值。记录结果(细胞OD值=细胞孔OD值-清零组OD值)。以不同单克隆亚系为横坐标,细胞增殖百分率(%)为纵坐标(以0 h增值率作为100%),使用Microsoft Excel软件绘制细胞生长曲线。

1.3.3软琼脂集落形成试验 取37℃保温的不同密度的细胞悬液9.4 ml移入小烧杯中,加入50℃5%琼脂0.6 ml,迅速混匀,立即浇入铺有底层琼脂(浓度为0.3%)的24孔培养板中,每孔加0.8 ml,置室温使琼脂凝固,每孔细胞数为100,接种14 d后,计算克隆数,每个集落细胞数≥50时为1个克隆。

1.3.4细胞周期检测 ①取传代生长良好的对数生长期细胞,0.25%胰酶消化收集细胞。加入4℃预冷的75%乙醇固定24 h,预冷PBS洗两次,1 000 rpm离心5 min,调整细胞浓度为1×106/mL。加入0.5 ml碘化丙啶(50 μ g/mL),4℃避光染色 30 min。流式细胞仪分析,在波长为488 nm、300 mv氩离子激光条件下,每份样品检测1×104/ml个细胞。

1.3.5RT-PCR 将选定细胞株分别接种24孔板,培养至对数生长期。胰酶消化制备细胞悬液,细胞裂解液加超声裂解细胞离心后取上清(各株分 5组)。按试剂盒说明操作。

1.3.6统计学分析 数据分析采用SPSS11.5统计软件包进行t检验,P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 细胞单克隆

96孔板中成功分离单细胞生长的约为60个,其中有23个克隆成功传至培养瓶中继续生长,余者皆发生凋亡或无法继续传代,在同等培养情况下,传至8-12代又有3个单克隆细胞亚系出现自发性的死亡,而无法继续传代。而分离出各单克隆细胞亚系的细胞大体形态差异显著。

2.2 细胞增殖

我们选取大体形态具有代表性的8个单克隆细胞株进行细胞生长曲线的测定,其中A3的倍增时间明显短于其他单克隆细胞株,存在明显差异。选取细胞都在4-16代之间,每次实验各克隆选取的细胞均为同一代次。而其中D1克隆则随着代次的增加,细胞增殖速度逐渐加快。图1为8个单克隆细胞株第四代的生长曲线。

图1 不同分化骨肉瘤细胞的生长曲线

2.3 细胞形态学

多数克隆与克隆前相似,以短梭形和多边形为主,细胞排列紧密,胞体大,突起细长,无接触抑制,易于堆叠,结团,A3形体稍小。另一类呈长梭形(A1,F1)胞体小,胞浆丰富,突起宽而短,有一定接触抑制,容易形成单细胞层

2.4 克隆形成率

D1细胞株形成的克隆数量最多,而最为显著的是D1的大克隆形成数目明显高于其他细胞株细胞。A3的克隆形成能力也明显高于母系MG63克隆率形成率。其中14天后观察A3 19.5%;D1 24.2%;大克隆形成率3%,MG63 4.3%.

2.5 成骨分化标志物的RT-PCR检测

A3细胞株OCN呈低表达,VEGF高表达,stathmin高表达,ALP低表达。

2.6 细胞周期分析

A3细胞株处于DNA合成期(S)的细胞数明显增多,而A1 D1细胞株的细胞大多处于GO/G1期,但S期的细胞数也明显多于MG63。

3 讨论

细胞株指的是从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法得到的同一细胞起源的细胞群[3]。在本实验的单细胞克隆筛选过程中,我们首先选取了被称为“Holoclone”的一类的克隆,而所谓的“Holoclone”是从克隆形态上就是指结构致密呈圆形或者椭圆形的克隆,很多学者研究表明形成不同克隆的肿瘤细胞,其具有完全不同的增殖、分化及成瘤能力。而这种情况也在乳腺癌、神经胶质瘤等肿瘤中得到了验证。这充分说明不同的肿瘤克隆形态根本就是不同的肿瘤分子聚合体的表现形式。而人成骨肉瘤MG-63细胞系是Billian切取高加索男孩骨肉瘤组织于体外连续传代培养建立的,并经过相关生物学鉴定。并非单细胞起源存在异质性。我们认为其应该具有更明显的肿瘤细胞间的差异。人成骨肉瘤细胞系MG63是具有成骨细胞的表型特征的细胞系,因此我们推断异质的细胞系各个细胞组分其具有不同的成骨分化程度,而其成骨分化标志物的表达也必然有所不同[4]。

经过对一系列的成骨分化标志物(如ALP、OCN、OPN、Stathmin)mRNA和蛋白水平上的检测,发现由MG63分离而来的多个单克隆细胞株确实在一部分成骨分化标志物的表达量上存在非常显著的差异,我们认为此类成骨分化标志物的检测可以作为判断临床骨肉瘤恶性程度的早期诊断标准。

而我们通过对ALP、OCN、OPN 、Stathmin等成骨细胞标志物的检测和所选取的几个代表性细胞株在大体形态、周期时相、集落形成、运动能力等方面具有明显的差异。软琼脂集落形成能力是衡量恶性肿瘤成瘤能力的重要指标[5],表示细胞锚着依赖性的丧失;细胞迁移、侵袭及粘附铺展实验是目前检测细胞运动能力的最为常用也是最为可靠的方法,反映肿瘤细胞在体内脱离原发器官的细胞外基质、侵袭而远处播散成瘤的能力;其中我们得到的细胞株D1的成瘤能力明显高于其他细胞株及母系MG-63.最后裸鼠体内的致瘤实验最直接地反映了各细胞株的恶性程度,细胞株之间存在着的这些细胞表型差异,对于调整和明确高侵袭、早转移的高度危险性骨肉瘤的早期诊断标准的调整很有意义。

近年来肿瘤干细胞学说已经对于很多高度恶性的异质性肿瘤的病因做出了解释,有学者通过悬浮成球实验,克隆形成等一系列实验能够证明确实在骨肉瘤细胞中有一个很小的细胞亚群具有自我更新能力,而通过本次研究我们推测具有高侵袭和高致瘤能力的细胞株A3、D1很可能为富集骨肉瘤类干细胞成分的单克隆细胞株。

要想对于骨肉瘤进行系统深入的研究,特别是分子水平的研究,细胞样本的纯度和可比性是关键。本实验使骨肉瘤细胞由“系”到“株”的目的就是建立一株既成分单一,又具有可比性,且存在分化程度差异的恶性肿瘤细胞从原发部位经淋巴、血液、体腔等途径播散到其他部位的过程为肿瘤的迁移,这是其区别于正常细胞的生物学特征之一。而根据骨肉瘤大体形态结合成骨分化标志的表达对骨肉瘤的分化程度进行区分,进一步对其恶性程度进行早期诊断是确实而有效的办法。

[1]Barrandon Y,Green H.Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:5390.

[2]Jones PH,Watt FM.Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression[J].Cell,1993,73:713.

[3]TomitasN,J iangW,Hibshoosh H,et al.Isolation and characterizationof a highly malignant variant of the SW480 human colon cancer cellline[J].Cancer Res,1999,52(24):6840.

[4]张 岩,姜 侃,冯尔宥,夏仁云.高 低不同分化特性人成骨肉瘤MG-63克隆细胞株的建立[J].中国矫形外科杂志,2005,13(13).

[5]石晓兵,陈安民.不同转移特性人成骨肉瘤MG-63细胞亚系的建立及特征[J].中国矫形外科杂志,2004,12(21):1675.

[6]Parker,Gibbs C,Kukekov VG,et al.Stem like cells in bone sarcomas:implications for tumorigenesis[J].Neoplasia,2005,11(7):9672.