尾加压素Ⅱ对肾小球系膜细胞FN、ColⅣmRNA表达的影响

赵 岩,林风武,李 才,王丽娟,巴丽薇

(1.吉林大学第二临床医院内分泌科,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院胸外科;3.吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室)

尾加压素Ⅱ(UⅡ)是新近发现的一种在生物界广泛存在的生长抑素样环状结构神经肽,是一种自分泌/旁分泌生长因子。研究发现,UⅡ对肾小球系膜细胞(MC)具有促丝裂作用[1],可能在糖尿病肾病(DN)发病机制中具有一定作用。本实验观察了UⅡ对体外高糖培养的MC纤连蛋白(FN)、IV型胶原(Col IV)mRNA表达的影响,旨在为进一步探讨UⅡ在DN发病中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠肾小球系膜细胞系购自上海坤肯生物化工有限公司;尾加压素Ⅱ购自美国Sigma公司;山羊抗大鼠UⅡ多克隆抗体购自Santa Cruz公司;PCR引物由上海生工生物技术公司合成;英国Techne TC-312 PCR扩增仪;德国Hermle/2K38离心机。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和干预 选用传代至5-10代生长良好的MC,经0.25%胰蛋白酶消化,制成单个细胞悬液,以每孔1×104的细胞数接种于12孔培养板中。当生长至覆盖瓶底面积70%时,更换无血清DMEM培养液,培养24 h后按下述干预条件进行分组:①对照组;②UⅡ组:终浓度10-8mol/L;③UⅡ+Ca2+通道阻断药尼卡地平组(尼卡地平,10-5mol/L,提前5 min加入);④UⅡ+Ca2+螯合剂 EDTA组(EDTA 2×10-3mol/L,提前30 min加入);⑤UⅡ+UⅡ抗体组(抗UⅡ抗体10-5mol/L,提前60 min加入)。每孔设6个复孔,培养24 h。

1.2.2RT-PCR检测FN、ColⅣmRNA表达水平

1.2.2.1细胞总RNA提取及RNA纯度测定 上述各组细胞弃上清,PBS冲洗后加入Trizol提取细胞总RNA。紫外分光光度计测260 nm/280 nm处紫外吸收值,重复三次取平均值。结果各组A260/A280在1.8-2.0之间,说明所提取RNA纯度高。

1.2.2.2逆转录反应 采用30 μ l反应体系。-20℃保存备用。

1.2.2.3引物合成 根据基因库检索大鼠FN、ColⅣ及内参对照物GAPDH mRNA序列,应用引物设计 软件设计引物,由上海生工生物技术公司合成。

Primer sequences for PCR products

1.2.2.4聚合酶链反应(PCR)采用25 μ l反应体系,退火温度因引物不同而不同,30个循环后,72℃延伸10 min,4℃保存备用。

1.2.2.5PCR产物的检测和分析 各泳道以PCR产物:上样缓冲液为5∶1(μ l)上样,恒压85 V 电泳。电泳结果在紫外灯下照相,用Tanon GIS-1000凝胶图像处理系统进行数据分析。

1.3 统计学处理

2 结果

与对照组比较,UⅡ组MC FN、ColⅣmRNA表达明显升高(P＜0.05);UⅡ+尼卡地平组、UⅡ+EDTA组及UⅡ+抗UⅡ抗体组MC FN、ColⅣmRNA表达明显低于UⅡ组(P＜0.05),UⅡ+抗UⅡ抗体组最为明显,比对照组稍高,但差异无统计学意义(P＞0.05),见表 1、图 1。

表1 UⅡ对 MC FN、ColⅣmRNA表达的影响

3 讨论

DN的早期病理改变为肾小球肥大、增生和细胞外基质(ECM)积聚。MC是肾小球的主要固有细胞,是ECM合成的主要场所,FN和Col IV是ECM的主要成分,反映ECM的代谢水平[2]。

图1 UⅡ对大鼠MC FN、ColⅣmRNA表达的影响

Watamabe等[3]研究发现,UⅡ能以自分泌/旁分泌方式作用于MC,对MC具有促增殖作用。大量体内外研究证实,系膜细胞增生与ECM增多之间有密切联系,二者在 DN发生、发展过程中起重要作用[4-6]。但UⅡ与ECM间关系目前还不清楚。

目前认为,UⅡ与其特异性受体GPR14结合,引起Ca2+内流,细胞内Ca2+升高,是引发其生物学作用的根本原因[7]。我们以10-8mol/LUⅡ[8]作为试验组,以UⅡ+Ca2+通道阻断剂尼卡地平、UⅡ+Ca2+螯合剂EDTA及UⅡ+抗UⅡ抗体作为UⅡ作用阻断组,观察了各组MC FN、ColⅣmRNA表达情况。结果显示,UⅡ组MC FN、ColⅣmRNA表达水平较对照组明显升高(P＜0.05),说明UⅡ能增加MC FN、ColⅣmRNA表达。各UⅡ阻断组MC FN、ColⅣmRNA表达水平明显低于UⅡ组(P＜0.05),且与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),说明这种促MC FN、ColⅣmRNA表达作用是UⅡ所特异的,且与Ca2+有关。这是UII直接作用还是间接作用的结果,还有待于进一步探讨。这一结果可能成为UⅡ参与DN发生发展的又一实验依据。

[1]张勇刚,陈亚红,马春艳,等.尾加压素Ⅱ的促丝裂作用[J].中国动脉硬化杂志,2001,9(1):14.

[2]Adler SG,Feld S,StrikerG,et al.Glomerular type IV collagen in patients with diabetic nephropathy with and without additional glomerular disease[J].Kindney Int,2000,57(5):2084.

[3]Watamabe T,Pakala R,Katagiri T,et al.Synergistic effect of urotensinⅡwith mildly oxidired LDL on DNA synthesis in vascular smooth muscle cells[J].Circulation,2001,104:16.

[4]Sharma K,Ziyadeh FN.The emerging role of transforming growth factorβin kidney diseases[J].Am J Physiol,1994,35:829.

[5]Mason RM,Wahab NA.Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy[J].Am Soc Nephrol,2003,14:1358.

[6]Fogo AB.Glomerular Hypertension,abnormal glomerular growth,and progression of renal diseases[J].Kidney Int,2000,75:S15.

[7]Ames RS,Sarau HM,Chambers JK,et al.Human urotensinⅡis a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14[J].Nature,1999,401:282.

[8]赵 岩,李 才,林风武,等.尾加压素II对体外高糖培养大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响[J].吉林大学学报(医学版),2008,34(6):954-958.