人肾细胞癌Notch信号途径相关基因的表达及其意义

钟加滕,刘 菲,衣豪伟,孙 琳,于慧美,杨冬艳

(1.吉林大学基础医学院病理生理教研室,吉林长春130021;2.吉林大学临床医学七年制;3.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春130033)

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是成年人最常见的肾脏恶性肿瘤,而且其发病率仍在逐年增加[1]。肾细胞癌的自然过程极难预料,总的5年生存率很低。Notch信号途径是通过局部细胞间相互作用控制细胞命运的一种途径,它在进化中非常保守,在发育过程的调控中发挥重要作用.本实验对手术获得的肾细胞癌标本Notch信号通路相关受体、配体mRNA的表达水平进行研究,明确Notch与肾细胞癌的关系,为其作为肾癌筛选标志物提供理论依据,揭示肾细胞癌发生发展的可能分子机制,从而提高治疗的合理性和有效性。

1 材料与方法

1.1主要试剂Trizol试剂、RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司;高保真TaqDNA聚合酶、MMV逆转录酶、DNAMarker、DNA凝胶回收试剂盒均购自大连宝生物工程公司;琼脂糖购自北京鼎国生物技术有限公司。引物合成由上海生工生物工程技术服务公司完成。溴化乙锭DEPC购自德国Merk公司;dNTP购自Promega公司;其它常规化学试剂均为分析纯产品。

1.2标本获取与保存超声引导下穿刺活检及手术获得2007年9月至2009年5月到中日联谊就诊并被诊断为肾细胞癌的患者的肾细胞癌标本,将收集好的标本立即放入液氮中保存。

1.3RT-PCR 检测Notch信号通路受体Notch-2、Notch-3和Notch信号通路配体 Jagged-1、Delta-1mRNA水平液氮研磨组织块,用TRIzol试剂提取组织中的总RNA,采用逆转录酶和Oligo d(T)18、dNTP将总 RNA逆转录成 cDNA,之后取 1 μ l进行 PCR(Takara)反应。以GAPDH为内参照,引物序列及PCR产物片断大小见表1,PCR反应条件:Notch-2、Jagged-1和 Delta-1为30循环 ,变性 94℃、30 s,退火55℃、30 s,延伸 72℃、30 s;Notch-3 为 30循环,变性94℃、30 s,退火 56℃、30 s,延伸 72℃、30 s;GAPDH为28 循环,变性 94℃、30 s,退火 58℃、30 s,延伸72℃、30 s。扩增产物用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳分析(上海天能科技有限公司GIS凝胶成像系统),以目的基因电泳条带密度值灰度×面积与内参GAPDH比值确定其含量。

1.4统计学分析结果以s表示,采用SPSS 13.0统计学软件对8例癌症组织和癌旁组织标本中Notch信号通路分子的表达水平进行统计学分析,各项检测指标比较采用t检验。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1Notch信号通路受体Notch-2 mRNA水平的RTPCR的结果显示与癌旁组织相比,癌症组织中Notch-2 mRNA水平明显升高(P＜0.01),结果见表2,差异有统计学意义,其中三例标本的RT-PCR电泳结果见图1。

2.2Notch信号通路受体Notch-3 mRNA水平的RTPCR的结果显示与癌旁组织相比,癌症组织中Notch-3 mRNA水平明显升高(P＜0.01),结果见表2,差异有统计学意义,其中三例标本的RT-PCR电泳结果见图1。

2.3Notch信号通路配体Jagged-1 mRNA水平的RT-PCR的结果显示与癌旁组织相比,癌症组织中Jagged-1 mRNA水平明显升高(P＜0.01),结果见表2,差异有统计学意义,其中三例标本的RT-PCR电泳结果见图1。

2.4Notch信号通路配体Delta-1 mRNA水平的RTPCR的结果显示与癌旁组织相比,癌症组织中Delta-1 mRNA水平明显升高(P＜0.01),结果见表2,差异有统计学意义,其中三例标本的RT-PCR电泳结果见图1。

Fig.1 The Notch-2、Notch-3、Jagged-1and Detla-1 mRNA expression in kidney carcinoma tissue

2.58例电泳结果的灰度值比较见表2

3 讨论

Notch信号途径是通过局部细胞间相互作用控制细胞命运的一种途径,它在进化中非常保守,在发育过程的调控中发挥重要作用。哺乳动物有4种Notch受体(Notch1-4)和5种配体(Jagged1,2和Delta 1,3和4)。在正常情况下Notch信号转导系统能调节细胞对分化信号的识别能力,在调控细胞生长分化、组织更新及调节细胞内环境稳定中发挥重要作用。人类许多实体瘤及血液系统肿瘤均发现Notch1受体的异常表达[2-6],越来越多证据表明Notch1与肿瘤发生有关。但在不同肿瘤细胞中的具体表现又有明显的不同,Notch信号途径在肿瘤细胞中具有双重特性。多数研究结果显示Notch具有促癌作用,但也有文献报道为抑癌作用。Tonon等[7]阐述了Notch作为癌基因在信号通路中的作用,而Nicolas等[8]则提出在鼠皮肤癌发生中,Notch1为抑癌作用而不是促癌作用。此外,还有研究证明人的乳腺癌中,Notch1常与肿瘤的发生有关,而Notch2与肿瘤的抑制有关[9]。与之相反,人的脑肿瘤中,Notch1与肿瘤的抑制有关而Notch2与肿瘤的发生有关[10]。这是由于大多数肿瘤表达不只一种Notch配体和/或受体,因此这些配体/受体总的表达最终决定Notch信号是促进肿瘤的发生还是抑制肿瘤的发生。

表2 8例肾细胞癌标本Notch信号途径分子表达水平

目前对于肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)的发生发展与Notch信号通路的关系的研究在逐渐增多,最新的研究表明[11],Notch信号通路在RCC的发生发展过程中发挥着重要的作用,本实验的研究结果显示,Notch信号通路的受体Notch-2、Notch-3以及Notch信号通路的配体Jagged-1在癌症组织中的表达有了明显的升高,提示Notch信号通路与RCC的发生呈现出一定的相关性,为其作为肾癌筛选标志物提供一定的理论依据。但是明确Notch信号通路与RCC发生发展之间的关系还需要做进一步研究。

[1]Sweeney JP,Thornhill JA,Graiger R,et al.Incidentally detected renal cell carcinom a:pathological features,survival trends and implications for treatment[J].BrJU rol,1996,78(3):351.

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[3]Leethanakul C,Patel V,Gillespie J,et al.Distinct pattern of expression of differentiation and growth-related genes in squamous cell carcinomas of the head and neck revealed by the use of laser capture microdissection and cDNA arrays[J].Oncogene,2000,19(28):3220.

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[5]Jundt F,Schulze Proebsting KS,Anagnostopoulos I,et al.Jagged1-induced Notch signaling drives proliferation of multiple myeloma cells[J].Blood,2004,103(9):3511.

[6]Nickoloff BJ,Osborne BA,Miele L.Notch signaling as a therapeutic target in cancer:a new app roach to the development of cell fate modifying agents[J].Oncogene,2003,22(42):6598.

[7]Tonon G,Modi S,Wu L,et al.t(11;19)(q21;p13)translocation in mucoepidermoid carcinoma creates a novel fusion product that disrupts a Notch signaling pathway[J].Nat Genet,2003,33(2):208.

[8]Nicolas M,WolferA,Raj K,et al.Notch1 functions as a tumor suppressor inmouse skin[J].Nat Genet,2003,33(3):416.

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[10]Fan X,Mikolaenko I,Elhassan I,et al.Notch1 and notch2 have opposite effects on embryonal brain tumor growth.Cancer Res.2004;64:7787.

[11]Sun S,Du R,Gao J,et al.Expression and clinical significance of Notch receptors in human renal cell carcinoma.Pathology,2009,41(4):335.