郁金对CCl4急性肝损伤小鼠肝细胞bcl-2及bax表达的影响

韩向北,许 多,郭亚雄,李德龙,程 宏,朱彤彤#,张婉娴*,赵丽晶,赵丽娟*

(1.吉林大学白求恩医学院病理生理教研室,吉林长春130021;2.吉林省人民医院)

郁金作为传统中草药,具有来源广泛、价格低廉、作用多样且疗效确切等优点。现代研究表明,郁金具有调节免疫、抑制中枢神经、抗自由基损伤、改善血液流变学、诱导肿瘤细胞凋亡,抗肝纤维化等作用[1-3]。单味郁金水煎剂对受损肝细胞凋亡及其机制的研究却少有报道。本实验通过检测肝细胞Bcl-2、Bax基因及蛋白水平的表达变化,探讨单味郁金水煎剂对CCl4急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物ICR小鼠,体重18-22 g,雌雄各半,由吉林大学实验动物中心提供。

1.2药物与主要试剂郁金购于吉林大药房;甘利欣注射液(连云港正大天晴制药有限公司,批号20040825)实验时用10%葡萄糖配制;四氯化碳(武汉市江北化学试剂厂,批号20021112);TUNUL试剂盒、Trizol购自美国invitrogen公司,逆转录试剂盒购于MBI公司;bcl-2、bax及GAPDH的PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。抗体购自美国san-ta cruz公司。

1.3动物分组与给药ICR小鼠48只,雌雄各半,随机分为6组,每组8只:阳性药组(甘利欣22.5 mg·kg-1),郁金高 、中 、低剂量组(12g·kg-1、6 g·kg-1、3 g·kg-1),空白对照组及模型组(等体积蒸馏水),灌胃给药,1次/d,连续给药7 d。第7 d给药1 h后造模。

1.4模型制备参照文献[4],各组(空白对照组除外)小鼠以0.2%CCl4橄榄油溶液10ml·kg-1腹腔注射,禁食不禁水24 h,称重后眼球取血处死,快速取出肝脏。

1.5血清生化指标检测按试剂盒方法(赖氏法)测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),门冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量。

1.6TUNUL染色观察凋亡细胞参照试剂盒说明进行TUNEL染色,阳性细胞呈绿色荧光,在激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.7RT-PCR法检测Bcl-2、bax的转录情况遵循PCR引物设计原则,根据GeneBank鼠基因cDNA序列,分别设计Bcl-2、bax及Gapdh引物。序列见表1,提取肝组织总RN A,琼脂糖凝胶电泳鉴定,并根据A260值计算RNA浓度。取4 μ g总RNA行逆转录反应,反应体系中加1 μ l随机引物,加双蒸水定容至12 μ l,70℃温育 5 min,冰浴后加入 10 μ MdNTP Mix 2 μ l,5×缓冲液 4 μ l,RNA 酶抑制剂(20 U)1 μ l,25℃温育5 min,加入逆转录酶(200 U)1 μ l,终体系为 20 μ l,25℃、10 min,42℃、60 min,72℃、10 min。而后进行PCR反应,反应体系为:cDNA稀释液1 μ l,20×SYBR PCR 主反应液 9 μ l;上下游引物各 1 μ l(0.25 μ M);去离子水 13 μ l;总体积 25 μ l;反应条件为:94℃变性 5 min,94℃变性 30 s,55-57℃30 s,72℃延伸45 s,30个循环,最后72℃延伸5 min。以Gapdh作为内参照。每个样本做三个副管。随机Rotor-Gene软件分析,双标准曲线法计算基因表达量。

Tab.1 Bcl-2、bax and Gapdh

1.8免疫组织化学染色观察bcl-2及bax蛋白表达变化用一抗检测肝组织细胞内的抗原,再用显色物质标记的二抗检测一抗,放大检测信号,阳性细胞被染为棕色。肝组织切片脱蜡后水洗,蒸馏水洗,PBS洗。3%H2O210 min后自来水充分水洗,蒸馏水洗,PBS洗。热抗原修复或消化将切片置入抗原修复液中,用微波炉加热至沸腾10-20 s。10 min后再加热一次。再10 min后取出冷却,至室温后蒸馏水洗,PBS充分洗。加正常血清封闭20分钟弃血清后,直接加一抗:兔抗鼠(bcl-2和bax)抗体稀释比例为1∶50,37℃孵育 1 h。室温1 h,PBS充分洗。加(羊抗兔)通用型IgG抗体(Fab段)IgG/HRP,室温30 min。PBS充分洗。滴加DAB显色剂,在显微镜下观察直至出现棕色细胞。自来水充分洗,苏木精复染3 min。盐酸乙醇分化2 s,自来水充分洗。无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干观察。

1.9统计学处理实验数据以均数±标准差(s)表示。采用SPSS 11.0统计软件作 t检验和方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1血清ALT、AST的检测结果与空白对照组比较模型组血清ALT、AST水平显著增高(P＜0.01),表明急性肝损伤模型成立。与模型组相比,郁金各剂量组血清ALT、AST水平均明显降低,且呈剂量依赖性,统计学比较差异显著(P＜0.05,P＜0.01),说明郁金可明显减轻CCl4所致小鼠急性肝损伤,详见表2。

表2 郁金对CCl4急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(s,n=8)

表2 郁金对CCl4急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(s,n=8)

与对照组比较**P＜0.01;与模型组比较 ▲P＜0.05,▲▲P＜0.01

组别 剂量 ALT(U·L-1)AST(U·L-1)空白对照组 17.75±4.57 34.87±7.99模型组 75.27±10.31** 99.33±26.99**阳性药组 22.5 mg·kg-1 28.08±5.07▲▲ 44.87±12.30▲▲郁金大剂量 12 g·kg-1 36.11±6.52▲▲ 50.21±14.25▲▲郁金中剂量 6 g·kg-1 38.65±8.07▲▲ 52.23±13.66▲▲郁金小剂量 3 g·kg-1 48.13±17.91▲ 65.12±13.11▲

2.2TUNUL染色结果如图1所示:与空白对照组相比,模型组小鼠肝组织TUNUL染色阳性细胞数明显增多;而郁金给药组与模型组相比肝组织阳性细胞数却明显减少。说明单味郁金水煎剂可阻止肝细胞凋亡,减轻肝损伤。

图1 TUNUL染色结果(40×)

2.3Bcl-2及bax基因转录水平结果表明:与空白对照组比较,模型组Bcl-2基因转录水平明显降低、bax基因转录水平明显增高、Bcl-2/Bax比值下降;与模型组相比,郁金中、低剂量组Bcl-2基因表达明显上调、而bax基因表达明显下调、Bcl-2/Bax比值增大。各组间比较统计学差异显著(P＜0.05),详见表3和图2。

表3 Bcl-2及bax基因表达情况(s,n=3)

表3 Bcl-2及bax基因表达情况(s,n=3)

*P＜0.05**P＜0.01,与空白对照组比较;▲P＜0.05▲▲P＜0.01,与模型组比较

组别 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax空白对照组 0.589±0.049 0.377±0.103 0.335±0.901模型组 0.234±0.046**1.656±0.052**0.024±0.077*郁金中剂量组 0.519±0.100▲ 1.389±0.072▲ 0.057±0.195▲郁金低剂量组 0.526±0.096▲1.292±0.045▲▲0.066±0.226▲

图2 Bcl-2、bax基因表达情况

2.4Bcl-2及bax蛋白免疫组化染色结果与空白对照组比较Bcl-2蛋白在受损肝组织中表达明显减弱(胞浆呈棕黄染色的阳性细胞数减少);而郁金中、低剂量组肝细胞Bcl-2蛋白表达阳性细胞数比模型组明显增多,详见图4。与空白对照组相比bax蛋白在受损肝组织中表达增强。而与模型组比较,郁金中、低剂量组Bax蛋白表达阳性细胞数却明显减少,这与上述RT-PCR结果相一致,详见图3、图4。

3 讨论

本课题组前期实验结果已表明,单味郁金水煎剂具有明显改善肝功能;减轻肝组织炎症反应及肝细胞变性、死亡程度;降低肝组织氧化应激反应;调节肝细胞免疫平衡等作用[4]。为了观察单味郁金水煎剂是否具有良好的抗肝细胞凋亡作用并探究其机制,特设计本实验。

图3 Bcl-2免疫组化染色结果(40×)

本研究仍采用CCL4复制小鼠急性肝损伤病理模型。CCl4进入机体后可引发自由基产生增多而清除不足。自由基对肝细胞发生初步攻击的同时又可激活肝枯否氏细胞(Kupferps cells),使其释放细胞因子并进一步活化中性粒细胞等炎性细胞,通过一系列及联反应活化细胞的防御机制,这种防御反应被不断放大,就会出现肝细胞凋亡、炎症反应、粒细胞浸润等肝组织损伤[5,6]。

图4 Bax免疫组化染色结果(40×)

肝细胞损伤是一种由多因素介导的复杂的生物学过程,涉及多种学说和机制,其中肝细胞凋亡是肝损伤的一个基本特征。然而,在所有的凋亡途径中,线粒体似乎是肝细胞凋亡的中心执行者[7]。线粒体途径主要由Bcl-2家族蛋白调控,其中Bcl-2、Bax为重要的凋亡调控基因。Bcl-2为凋亡抑制基因,主要通过防止线粒体释放凋亡因子来发挥抗凋亡作用。bax是一种与Bcl-2相关的蛋白,其功能与bcl-2相反。Bcl-2家族成员的功能也包括它们形成同二聚体或异二聚体的能力,当细胞受到凋亡诱导因子刺激后是否存活取决于bcl-2/bax的比率,当bax增加时,形成bax-bax同二聚体,加速细胞凋亡;当bcl-2表达增强时,形成bcl-2-bax异二聚体,抑制bax-bax同二聚体诱导的细胞凋亡[8]。本实验TUNEL结果显示:郁金给药组与模型组相比肝组织阳性细胞数明显减少。说明单味郁金水煎剂可阻止肝细胞凋亡,减轻肝损伤;RT-PCR及免疫组化结果显示:模型组小鼠肝组织Bcl-2基因与蛋白表达均较空白对照组明显下调,而bax基因与蛋白表达则明显上调,结果bcl-2/bax比例降低而促进肝细胞凋亡。与模型组相比郁金给药组小鼠肝细胞bcl-2基因与蛋白表达明显上调,bax基因与蛋白表达却明显下调,bcl-2/bax的比例增高,遏制了肝细胞凋亡。说明单味郁金水煎剂抑制肝细胞凋亡的机制之一可能与调节肝细胞bcl-2/bax的比例有关。

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