C5-siRNA对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

何志红,吴素华,苏德华,唐,成伶俐

(1.盐步医院心内科,广东佛山528247;2.中山大学附属第一医院心内科;3.赣南师范学院体育学院)

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia and reperfusion,MI/R)损伤是指缺血心肌组织在恢复血液灌注后发生的细胞死亡或功能降低进一步加重。一般认为,参与心肌缺血再灌注损伤的主要因素有氧自由基、补体系统、中性粒细胞和钙超载。既往比较重视氧自由基、钙超载和中性粒细胞。但近来的研究发现,补体系统激活后产生的各种补体成分在心肌缺血再灌注损伤中起着相当重要的作用。大量在体实验已经证实抑制补体可以明显减轻心肌缺血再灌注损伤。缺血和缺氧有着及其相似的病理改变和发病机制。本研究采用离体培养的乳鼠心肌细胞建立缺氧/复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)损伤模型,模拟在体心肌缺血再灌注损伤,应用RNA干扰技术通过C5-siR NA特异性地抑制C5表达,从而探讨其对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。

1 材料与方法

1.1材料携带C5-siRNA的慢病毒(美国Santa Cruz biotechnology公司提供)。新生5 d SD大鼠【由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:S CXK(粤)2008-0020】。普通PCR仪:MyCycler(美国 BIORAD公司生产)。酶标仪 :MK3(芬兰LAB公司提供)。细胞培养箱:美国THERMO公司生产的3110。CCK-8试剂由TONGREN公司提供。RT试剂:加拿大fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1心肌细胞的培养 取5日龄Wistar大白鼠乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡后用针头固定于泡沫板上,开胸取心放入D MEM液中。剔除心脏周边的血凝及纤维组织 ,置于 另一D MEM培养皿中。将心脏剪成1mm3的碎块,用300目网筛研磨滤过,冲洗3 000 rpm离心取沉淀后,取0.25%胰酶0.3 g/L胶原酶3 ml 37℃消化10 min,加完全培养基终止消化,3 000 rpm离心取沉淀细胞用含青链霉素、10%FBS的DMEM完全培养基接种于100 mm的培养皿中,37℃、5%的CO2饱和湿度下培养过夜帖壁,待铺满90%底面积后,平均接种于6孔板中。

1.2.2心肌细胞分组造模 各组细胞均换用低氧(3%O2。、5%CO2、92%N2)培养箱中预饱和30 min的无血清DMEM培养基。H/R组、H/R+C5-siRNA组,H/R+空载体病毒组均于37℃,3%O2、5%CO2、92%N2环境中培养2 h后放入常氧培养箱中继续培养4 h,造成H/R损伤。其中H/R+C5-siRNA组及H/R+空载体病毒组在缺氧前2 h予C5-siR NA及空载体病毒(1.0×106IFU)。对照组于常氧环境下持续培养。将培养的心肌细胞随机分为4组:对照组、H/R组、H/R+C5-siRNA组,H/R+空载体病毒组。

1.2.3心肌存活情况检测(CKK-8 OD值)细胞对数增殖期用0.25%胰蛋白酶消化后按每孔1×104接种96孔细胞培养板,平行做8孔 ,各孔按设计加入试剂后按上述条件培养,显微镜下观察各组细胞,弃上清,加入CCK-8溶液。选择波长450 nm波长,用酶标仪测定各孔OD值。

1.2.4C5的测定 采用RT-PCR法从RNA水平测定C5的表达量及采用Western Blot法从蛋白质水平测定C5的含量。根据 C5基因序列,引物设计序列如下:上游引物:5′-TCAAATGTGACGGTGCTAAA-3′、下游 引 5′-TCAGGTATTCTCCCACAAGC-3′;目的基因为172 bp。 内参GAPDH 上游引物:5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′、 下 游 引 物:5′-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3′目的基因为233 bp。以上引物由深圳市欣海凌生物科技有限公司合成。由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR反应参照Promega公司R T-PCR试剂盒说明书进行,PCR扩增条件的设置:94℃4分钟;94℃20秒58℃30秒 72℃30秒循环28次,以GAPDH为内参,分析比较各组灰度值。取扩增终产物10μ l,在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳,紫外光下观察。

1.2.5统计学处理 所有实验数据均以s表示。计量数据采用SPSS13.0统计软件进行方差分析及组间q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1C5-siRNA对心肌存活情况的影响H/R+C5-siRNA组OD值明显高于H/R组及H/R+空载体病毒组(表1),P＜0.05,提示C5-siRNA对心肌细胞H/R损伤有保护作用。

表1 对心肌增殖情况(OD均值)的影响

2.2RT-PCR法测定C5 RNA的表达量H/R+C5-siRNA组灰度值明显低于H/R组及H/R+空载体病毒组(图1)。

图1 各组C5 RNA PCR扩增图

2.3Wenstern Blot法测定C5蛋白的表达量H/R+C5-siRNA组灰度值明显低于H/R组及H/R+空载体病毒组(图2)。

图2 各组C5蛋白的电泳图

3 讨论

自从上世纪60年代以来,国内外大量研究证实补体系统是参与心肌缺血再灌注损伤的重要因素。Hill和Ward首次在鼠的心肌梗死区中发现补体C3,并认为补体系统激活是参与缺血再灌注损伤的一重要因素[16]。Yasojima等[15]对兔离体心脏进行Langedorf灌流首次证明心肌组织自身能够表达补体基因和蛋白且其对心肌缺血性损伤的程度起主要作用。这也为我们的离体研究提供了理论依据。

补体系统是由近30种可溶性蛋白质和膜结合蛋白(C1q,C3b,iC3b,C3a,C5a,C5b-9等)组成的多分子系统。正常生理状态下的补体系统是人体免疫系统的一个重要组成部分,其主要功能为启动免疫反应、溶解病原体,促进吞噬及组织的修复等。补体激活级联反应产生一系列生物活性物质,包括早期激活产物(如C3b、C3a和 iC3b)和晚期激活产物(如C5a,C5b-9)。早期产物如C3b主要发挥调理作用和促进吞噬,对维持机体正常免疫功能至关重要。补体激活晚期产物如C5a的促炎作用和攻膜复合物C5b-9的溶细胞作用是加重组织损伤的关键因素[7,8]。基于上述原因,抗补体治疗的理想靶点是阻断补体晚期激活产物的产生,因而在我们的研究中,选择C5水平为阻断位点,依然保留C5上游的补体级联反应,从而一方面使机体必要的免疫功能得以最大程度的保留,另一方面又可以抑制C5下游晚期产物C5a,C5b-9的形成,达到保护缺血组织的目的。

本实验结果表明,C5-siRNA对缺氧-复氧心肌损伤有显著保护作用,C5-siRNA能特异性抑制C5-RNA表达,进而使C5表达量下降,抑制了C5下游级联反应,使过敏毒素C5a和巩膜复合物C5b-9明显减少,从而达到减轻心肌缺血再灌注损伤的目的。我们前面在在体实验中已经证明C5-siR NA在MI/R中的保护作用,通过离体实验我们进一步证实了C5-siRNA在MI/R的特殊地位,相对传统的补体阻断剂,它具有特异性高,稳定性强,高效能等优点。基于上述原因及我们在体内外实验的研究结果,我们推测C5-siRNA有望成为一种理想的补体阻断剂而用于临床。

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