中药植物金线吊乌龟对植物病原真菌的抗菌活性

玉艳珍, 邓业成, 张 明, 覃 旭, 李丽芬, 骆海玉

(广西师范大学生命科学学院,药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室,桂林 541004)

金线吊乌龟(Stephania cepharantha Hayata)为防己科千金藤属植物,分布于我国的大部分地区,生长在村边、旷野、林缘等处土层深厚的地方,也可生长在石灰岩地区的石缝或石砾中。金线吊乌龟的块根为民间常用草药,称白药、白药子或白大药,味苦性寒,有清热解毒、消肿止痛之功效,常用于治疗痈疽肿毒、腮腺炎、毒蛇咬伤等。块根含多种生物碱[1],药理学试验表明,它们具有多种临床药理活性,如增强免疫调节,促进血管舒张,抗HIV-1,抗癌,抗过敏等[2-5]。金线吊乌龟还有杀虫活性,平新亮[6-7]和刘艳华[8]等报道了其对白纹伊蚊、菜青虫和萝卜蚜的生物活性。目前为止,其抗菌活性未见报道。本文以农业重要植物病原真菌为供试菌,对金线吊乌龟的抗菌活性及活性成分进行了初步研究,以期为金线吊乌龟在农业领域的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

金线吊乌龟(Stephania cepharantha Hayata)块根采自桂北地区。

1.1.2 供试植物病原真菌

柿角斑病菌(Cercospora kaki Ell.et Ev.)、梨锈病菌(Gymnosporangium haraeanum Syd.)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav.)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani Kühn)、玉米炭疽病菌[Colletotrichum graminicola(Ces.)Wilson.]、甘蔗凤梨病菌[Thielaviopsisparadoxa(de Seynes)V.Hohnel]、西瓜枯萎病菌[Fusarium oxysporum f.sp.niveum(E.F.Smith)Syn.et Hans]、柑橘疮痂病菌(Sphaceloma f awcettii Jenkins)。上述病原真菌通过从田间采集植物发病部位,在室内用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)分离纯化获得。

1.1.3 供试对照药剂

96%多菌灵原粉：江苏新沂市经纬化工有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 提取物的制备

参照阳振等[9]的方法,采用有机溶剂冷浸提取法对金线吊乌龟的块根进行提取。将采集的植物材料洗净泥土和杂质,放在室内通风处晾干,再在60℃的恒温鼓风干燥箱中烘干至发脆,用植物粉碎机粉碎,过40目筛。称取一定量的植物干粉,放入1 000 mL三角瓶中,加入5倍量甲醇,在室温下浸提(其间每隔12 h振荡一次)24 h后倾出上层浸提液,再往三角瓶中加5倍量甲醇继续浸提24 h,2次浸提液合并,抽滤,滤液用旋转蒸发仪在水浴中减压浓缩,蒸干溶剂,得膏状植物粗提物,密封,放置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 对病原真菌菌丝生长的抑制活性测定

参照陈年春[10]的菌丝生长速率法进行测定。将供试菌接种在PDA平板培养基上扩大培养,备用。用V(丙酮)∶V(无菌水)=1∶1将样品配成一定浓度的药液备用。无菌条件下,吸取1 mL药液(对照组用V(丙酮)∶V(无菌水)=1∶1代替)与热熔的9 mL PDA培养基混匀,倒入直径9 cm的培养皿中,制成厚薄均匀的带药培养基。用直径为0.4 cm的打孔器在已扩大培养的供试菌落边缘切取菌饼,将菌饼接入带药培养基上,使有菌丝的一面朝下,每皿接3个菌饼,呈品字形分布,每个处理设3个重复,置(27±1)℃的恒温培养箱中培养。用十字交叉法测量培养72 h(水稻纹枯病菌测量48 h)后的菌落直径,根据下式求出抑菌率：

菌落直径(cm)=测量直径(cm)-0.4 cm;

抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

测定有效中浓度时,用丙酮和水组成的混合溶剂配制5个以上系列浓度的药液,测定各个浓度的抑菌率,用最小二乘法求出毒力回归方程、有效中浓度EC50等。

1.2.3 对病原真菌孢子萌发的抑制活性测定

参照慕立义[11]的孢子萌发法。用少量丙酮将样品溶解,再用无菌水配成一定浓度的药液,备用。往事先培养好的供试菌中加适量无菌水,用涂布棒在菌落表面摩擦,使孢子脱落悬浮于无菌水中,用双层纱布过滤后,配成孢子悬浮液(孢子密度为低倍镜下每视野80个左右),备用。取9 cm直径的培养皿,在皿盖内铺上一层滤纸,并以水湿透,再将U型玻棒置于皿中央。将孢子悬浮液与药液等量混合,用滴管加一滴混合液于干净的载玻片表面(载玻片事先用0.25%火棉胶乙醚溶液处理过),然后将载玻片反放到U型玻棒上,使液滴向下,形成“悬滴”。将皿底扣上,置于(27±1)℃培养箱中培养。每个处理设3个重复。将处理过的孢子培养一定时间后,检查并记录孢子萌发的情况(每个处理在低倍镜下随机检查200个孢子),按下式计算孢子萌发抑制率。

萌发率=孢子萌发数/检查孢子总数×100%;

1.2.4 活性物质的初步分离

按照以下程序(图 1)对活性成分进行初步分离,将块根提取物分离成3部分,即非生物碱、氯仿层生物碱和正丁醇层生物碱。

图1 金线吊乌龟抑制病原菌活性成分的初步分离程序

2 结果与分析

2.1 金线吊乌龟块根甲醇提取物对5种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性

采用菌丝生长速率法测定了金线吊乌龟块根甲醇提取物对5种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性,结果见表1。结果表明,金线吊乌龟提取物对梨锈病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌和玉米炭疽病菌有很高的抑制活性,质量浓度为10 g/L时,抑菌率分别为97.74%、100.00%、94.51%和84.40%,对柿角斑病菌的活性较低,抑菌率只有67.59%。广谱杀菌剂多菌灵在质量浓度为1 g/L时,对柿角斑病菌、水稻纹枯病菌以及玉米炭疽病菌的抑菌率均为100.00%,但对梨锈病菌和稻瘟病菌的抑制活性低,抑菌率分别只有10.27%和23.94%。

表1 金线吊乌龟块根甲醇提取物对5种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性

2.2 金线吊乌龟块根甲醇提取物对5种植物病原真菌菌丝生长的毒力

为进一步明确金线吊乌龟块根的抗菌效果,测定了其甲醇提取物对5种植物病原真菌菌丝生长的毒力,结果见表2。由表2可知,金线吊乌龟块根甲醇提取物对柿角斑病菌、梨锈病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌和玉米炭疽病菌的EC50分别为1.349 1、0.587 9、0.312 2、0.280 7 g/L 和0.835 3 g/L;对照药剂多菌灵对柿角斑病菌、水稻纹枯病菌和玉米炭疽病菌的EC50分别为8.717 1×10-5、7.544 7×10-4g/L和 8.738 4×10-5g/L,对3种病原真菌的毒力远远高于金线吊乌龟。

表2 金线吊乌龟块根甲醇提取物对5种植物病原真菌菌丝生长的毒力

2.3 金线吊乌龟块根甲醇提取物对4种植物病原真菌孢子萌发的抑制活性

在实验室条件下,采用孢子萌发法测定了金线吊乌龟块根甲醇提取物对4种植物病原真菌孢子萌发的抑制活性,结果见表3。在质量浓度为10 g/L时,金线吊乌龟甲醇提取物能很好地抑制甘蔗凤梨病菌孢子、柑橘疮痂病菌孢子和梨锈病菌孢子的萌发,对以上3种病原真菌孢子萌发的抑制率分别为91.80%、97.00%和100.00%。金线吊乌龟对西瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制效果比较差,抑制率仅为20.63%。

表3 金线吊乌龟块根甲醇提取物对4种病原真菌孢子萌发的抑制活性1)

2.4 金线吊乌龟块根甲醇提取物粗分各部分的抗菌活性

对金线吊乌龟块根甲醇提取物进行了初步分离,将其分成非生物碱、氯仿层生物碱和正丁醇层生物碱3部分,各部分的百分含量分别为14.12%、13.53%和11.76%。

采用菌丝生长速率法测定了非生物碱、氯仿层生物碱和正丁醇层生物碱3部分的抗菌活性,结果见表4。当处理浓度为2 g/L时,氯仿层生物碱对柿角斑病菌、梨锈病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌和玉米炭疽病菌的抑菌率分别为51.53%、85.65%、72.93%、75.22%和61.97%,抑菌率均高于正丁醇层生物碱和非生物碱部分,说明金线吊乌龟的抗菌活性成分主要是氯仿层生物碱。

表4 金线吊乌龟粗分各部分对5种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性1)

3 结论与讨论

经活性测定发现,金线吊乌龟块根甲醇提取物对梨锈病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌和玉米炭疽病菌这4种植物病原真菌菌丝生长具有显著的抑制活性,但对柿角斑病菌的活性较低;同时,金线吊乌龟提取物对甘蔗凤梨病菌孢子、柑橘疮痂病菌孢子和梨锈病菌孢子的萌发具有显著的抑制效果。由此可见,金线吊乌龟不仅具有抗菌广谱性,且可能具有多种抗菌作用方式。金线吊乌龟的块根含多种生物碱,经初步分离,并结合生物活性追踪,发现金线吊乌龟的抗菌活性成分主要是存在于氯仿层的生物碱,可采用色谱、光谱技术对其中的活性化合物做进一步的分离、纯化和鉴定,为新农药的创制提供先导化合物,这对新农药的创制具有重要意义。以前的化学杀菌剂因其作用位点单一而使病原菌容易产生抗性[12],而金线吊乌龟有可能具有多种抗菌作用方式,因此进一步探究其作用机理可为开发具有多作用位点的植物源杀菌剂提供重要的理论依据,丰富植物源天然产物农药的理论基础。需要指出的是,试验结果显示金线吊乌龟的粗提物抗菌活性远远低于化学农药多菌灵,这也是植物农药难以替代化学农药的重要原因。通过对活性成分的结构改造,有可能提高活性。

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