银杏内酯纳米粒细胞毒性研究

蒋青锋 陈志良 包 杰 刘喜荣 武金宝,4*

1 南方医科大学附属南方医院药学部（510515）

2 湖南玉新药业有限公司（410007）

3 南方医科大学附属南方医院检验科（510515）

4 包头医学院第二附属医院内蒙古消化病研究所（014030）

纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，美国、日本、德国等国家均已将纳米生物技术作为21世纪的科研优先项目予以重点发展。特别是纳米药物载体将来会在疾病的诊断、治疗和卫生保健等方面发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L929细胞株（南方医科大学病理教研室提供），银杏内酯（上海傲拓信息科技有限公司），胰酶，噻唑蓝(MTT)和DMSO (购自Sigma公司)，培养基RPMI 1640 (Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，96孔和6孔细胞培养板（Corning公司，美国），酶标仪(GE，美国)，AU5421全自动生化分析仪(Olympus，日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏内酯纳米粒的制备

采用表面聚合法制备银杏内酯PELGE纳米粒[1,2]。

1.2.2 实验分组与试验处理

实验分银杏内酯纳米粒组（实验组）、银杏内酯药物组（药物对照组）、空白纳米粒组（载体对照组）3组，分别用含10%胎牛血清RPMI-1640培养液溶解，按照试验需要制备100、75、50、25和1 mg/L 5个浓度剂量组，0.22µm微孔滤膜过滤除菌备用。

1.2.3 L929细胞培养

细胞在含10%胎牛血清（56℃热灭活30min）的RPMI-1640培养液中，置37℃，5%CO2孵箱中培养生长。细胞密度为1×109个/L，每1～2d传代一次，取指数生长期细胞用于实验。

表1 不同浓度银杏内酯纳米粒处理组对培养L929细胞LDH释放的影响（n=3，±s）

表1 不同浓度银杏内酯纳米粒处理组对培养L929细胞LDH释放的影响（n=3，±s）

组别对照组 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.67±1.15 26.00±1.00 25.33±1.15 1.405 0.311测定项目F P

表2 不同浓度银杏内酯药物（不含PBCA）处理组对培养L929细胞LDH释放的影响（n=3，±s）

表2 不同浓度银杏内酯药物（不含PBCA）处理组对培养L929细胞LDH释放的影响（n=3，±s）

组别对照组 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.00±1.00 26.33±2.08 25.67±0.58 0.583 0.642测定项目F P

表3 空白纳米粒（PBCA）处理组对培养L929细胞LDH释放的影响（n=3，±s）

表3 空白纳米粒（PBCA）处理组对培养L929细胞LDH释放的影响（n=3，±s）

对照组 100g/L 75g/L 50g/L LDH 活性(U/L) 25.00±1.00 26.00±1.00 25.00±1.00 24.67±1.15 0.923 0.472测定项目 组别F P

1.2.4 细胞存活率的测定

于96孔培养板接种L929细胞，每孔加入100µL，培养24h后，弃去原培养基，PBS液洗涤两次，实验组分别加入不同浓度的银杏内酯纳米粒、空白纳米粒（PBCA）和银杏内酯药物（不含PBCA），对照组加入培养液。继续培养2、4、7d，在各观察期取出一块培养板，每孔加入20µL MTT(0.5g/L)，孵化4h，吸去原液，加入150µL DMSO，置免疫酶标仪570nm 处测定吸光度，细胞生存率以百分率表示。按如下公式计算：

细胞生存率（%）=处理组A值/对照组A值×100%

1.2.5 乳酸脱氢酶（LDH）的释放

将制备好的细胞悬液接种于6孔培养板：分为空白组（细胞对照组）及不同浓度剂量的实验处理组，每组培养24h后，取细胞培养上清液于2000r/min室温离心3min，于全自动生化分析仪上测定漏出细胞外的LDH活性。

1.2.6 统计学处理

2 结 果

2.1 L929细胞培养

在倒置的相差显微镜下观察L929细胞系的生长情况，发现细胞呈梭形和多角形贴壁生长，具有典型的成纤维细胞的形态特征。细胞生长旺盛，约1d传代一次，细胞活力很强（图1）。

图1 光学显微镜下L929细胞形态（×100）

2.2 不同浓度银杏内酯药物银杏内酯纳米粒和空白纳米粒对L929细胞株生存率的影响

不同浓度银杏内酯药物、银杏内酯纳米粒和空白纳米粒对L929细胞株的毒性采用MTT法判定，结果以细胞的存活率表示（均值±标准差）。在2、4和7d时间点测定各浓度剂量的银杏内酯药物、银杏内酯纳米粒和空白纳米粒对L929细胞生长抑制作用是采用析因设计资料方差分析方法。析因方差分析结果显示银杏内酯药物各剂量组间差异不具有显著性（F= 1.590，P= 0.203）。各测量时间点间差异具有显著性（F= 67.653，P= 0.000）。对细胞生长抑制作用显著减弱，与高剂量组（10和5g/L剂量）相比差异极显著（P＜0.01）。在4d，5g/L剂量处理组与低剂量（1和0.5g/L剂量）相比，差异不显著（P＞0.05）。而10g/L剂量组与低剂量组差异显著（P＜0.05）。在7d，高剂量组（10和5g/L）对L929细胞生长仍有一定的抑制作用，与低剂量组相比差异极显著（P＜0.01）。在相同的测定时间点，细胞的生存率随着银杏内酯纳米粒剂量的减少而增高。相同浓度的银杏内酯纳米粒对细胞的影响随着细胞培养天数的增多而减少，组内差异均不显著（P＞0.05）。

2.3 不同浓度银杏内酯药物、银杏内酯纳米粒和空白纳米粒处理后L929细胞株LDH活性

经不同浓度（100、75和50g/L）的银杏内酯药物、银杏内酯纳米粒和空白纳米粒处理后，L929细胞株培养液中LDH活性与空白对照组比较均有所升高，但差异不具显著性（P＞0.05）（表1～表3）。提示各剂量组的上述3种药物对L929细胞株均无明显的细胞毒性。

3 讨 论

银杏内酯是一类有效的血小板活化因子受体拮抗剂，是治疗心脑血管疾病的常用药物[3-5]。当前市场上提供的银杏药物制剂有口服和静脉给药2种剂型，银杏内酯银杏的主要活性成分之一，其溶解吸收差，生物利用度不高，而且传统给药方式全身分布，靶器官和靶细胞血药浓度低，达不到很好的治疗效果[5,6]。为此，我们根据银杏药物内酯的作用机制，选择合适的靶向性药物载体研制出银杏内酯纳米粒，可将银杏内酯有效成分靶向导入脑内。 通过银杏内酯纳米粒的细胞毒性研究，为进一步验证其在脑内的分布、代谢、半衰期、生物效应奠定基础。研究结果显示，银杏内酯纳米粒与其药物对照银杏内酯及载体对照空白纳米粒相比，细胞毒性无统计学意义，其细胞毒性仅为Ⅰ级，说明研制的银杏内酯纳米粒生物相容性好，可以进一步研究其药效及药理作用，提示银杏内酯纳米粒研制获得了初步的成功。

[1]Olivier JC,Fenart L,Chauvet R,et al.Indirect evidence that drug brain targeting using polysorbate-80 coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles is related to toxicity[J].Pharm.Res,1999,16(12):1836.

[2]Haun JB,Devaraj NK,Hilderbrand SA,et al.Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection[J].Nat Nanotechnol,2010 Aug 1. [Epub ahead of print].

[3]Li LY,Zhao XL,Fei XF,et al.Bilobalide inhibits 6-OHDA-induced activation of NF-kappaB and loss of dopaminergic neurons in rat substantia nigra.[J].Acta Pharmacol Sin,2008,29(5):539-547.

[4]杨本明,刘红.银杏叶制剂临床应用新进展[J].中华医学研究与实践,2005,3(1):44-45.

[5]肖昭扬,孙长凯,肖绪武等.银杏叶提取物抗N-甲基-D-天冬氨酸受体介导兴奋毒性作用及机制研究[J].中华医学杂志,2006,86(35):2479-2484.

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