益气温阳、活血化瘀方对慢性病毒性心肌炎模型小鼠IL-2活性的影响1)

田 源,杨 颖,杜文旭

病毒性心肌炎(VMC)是临床较为常见的心血管疾病之一,心功能下降是病毒性心肌炎重要的病理特征。病毒性心肌炎的发病机制尚不明确,其中较为一致的观点是病毒的直接损伤作用和免疫机制(包括病毒诱导的免疫和自身免疫反应)[1]。本实验通过多次腹腔注射柯萨奇B3m病毒稀释液方式建立重复感染的VMC动物模型,并测定小鼠外周血清白细胞介素(IL)-2的含量,旨在研究益气温阳、活血化瘀方对VMC小鼠外周血清IL-2的影响,为益气温阳、活血化瘀方临床治疗VMC提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性BALB/c小鼠120只,3周～4周龄,购自北京军事医学科学院实验动物中心[动物合格证号:SCXK-(军)]。

1.2 病毒 柯萨奇B3m病毒由哈尔滨医科大学克山病研究所提供,在Hela细胞中传代,冻融 3次,离心(2 000 r/min)10次,上清液分装,在Hela细胞中测50%组织感染率(TCID)为10-7,-70℃保存备用。

1.3 药物 益气温阳、活血化瘀方主要由黄芪、人参、肉桂、附子、川芎、丹参、大青叶等组成。中药经水提取,制成浸膏,含水量为21%。用蒸馏水稀释,调整浓度为82%,即相当于1 mL悬液中含生药4.3 g,由黑龙江中医药大学制剂室提供。

1.4 动物模型的复制及分组

1.4.1 小鼠慢性病毒性心肌炎的模型复制 分别于1 d、8 d、15 d、22 d、36 d、50 d 6次经小鼠腹腔接种柯萨奇 B3m病毒稀释液接种病毒。空白组于实验相同时点给予同体积的RM1640液。

1.4.2 试验分组 将存活慢性病毒性心肌炎小鼠120只,随机分为模型组、空白组、中药治疗组,每组40只。

1.4.3 给药方法 中药组及西药组于末次病毒感染后10 d灌胃,中药组予益气温阳、活血化瘀方混悬液10.35 g/(kg◦d)灌胃,空白组和模型组灌胃同体积生理盐水。每日1次,灌胃4周。全部灌胃结束后模型组剩余33只,中药组剩余39只,空白组剩余38只。

1.5 IL-2检测 采用IL-2检测试剂盒,购于北京晶美生物技术有限公司。采用酶联免疫吸附法检测外周血IL-2活性,严格按照试剂盒操作方法进行检测。

1.6 形态学观察 心脏标本立即固定于4%多聚甲醛中,石蜡包埋切片,厚度为5 μ m,常规苏木精-伊红染色后进行光镜形态学观察。

1.7 统计学处理 应用SPSS 13.0 for Windows统计软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示,多组均数间的比较应用方差分析,两两比较应用q检验,样本率的比较用χ2检验。

2 结 果

2.1 3组小鼠心肌组织病理形态学改变 空白组心肌纤维排列整齐,间质血管无改变,未见心肌细胞变性、坏死;模型组心肌纤维排列紊乱、断裂,心肌细胞肥大,空泡变性,血管充血出血,少量炎细胞浸润,间质纤维化明显;中药组心肌纤维排列紊乱较轻微,未见心肌断裂,血管充血出血,少量炎细胞浸润间质纤维化程度轻微。

2.2 3组小鼠外周血IL-2水平比较 血清IL-2的含量模型组、中药组与空白组比较明显增高(P＜0.01);中药组与模型组比较,差异也有统计学意义(P＜0.01)。详见表1。

表1 3组小鼠外周血IL-2水平比较(±s)

表1 3组小鼠外周血IL-2水平比较(±s)

组别 n IL-2(pg/mL)空白组 38 18.01±1.09模型组 33 29.04±1.421)中药组 39 23.37±0.981)2)与空白组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.01

3 讨 论

众多的临床及实验研究证实,VMC的急性期、慢性期甚至在扩张型心肌病的晚期均存在病毒的持续感染。T淋巴细胞作为免疫效应细胞,其对病毒感染心肌细胞的攻击是心肌坏死的机制之一,而IL-2是促使免疫效应细胞分化、增殖的重要介质。有研究表明,VMC迁延期或慢性期IL-2水平增高,IL-2是参与免疫调节和炎症反应的重要细胞因子[2]。Seko等[3]认为,IL-2在体内可诱导激活的T细胞损害已有炎症的心肌细胞和未损伤的心肌细胞。故心肌损伤病理严重程度与血中IL-2的浓度密切相关[4]。

本实验显示,中药组的含量均较模型组明显减低,但较空白组高,且中药组的病理形态学改变明显轻于模型组,说明益气温阳、活血化瘀方可减轻病毒感染所致的VMC自身免疫介导的心肌组织损伤,其作用机制可能主要为抑制IL-2过度分泌,从而对T细胞、细胞因子及NK细胞产生一系列的相关影响,减轻心肌细胞的损伤。但其确切作用机制则有待进一步研究和探索。因此观察病毒性心肌炎慢性期IL-2与心肌细胞损伤的关系,可帮助了解到病毒性心肌炎的病理变化过程,为临床治疗病毒性心肌炎慢性期提供实验依据。

[1]朴圣爱,王有鹏.羚桂龙牡颗粒对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞外信号激酶1和2的影响[J].中药信息,2009,26(1):77-78.

[2]刘强,李树雯,程志清.清心饮对 VMC小鼠细胞免疫调节作用的实验研究[J].中药新药与临床药理,2001,13(3):154-156.

[3]Seko Y,Yagita H,Okumura K,et al.T cell receptor VB gene expression in infiltrating cells in murine hearts with acute myocarditis caused by coxsackievirus B3[J].Circulalton,1994,89(5):2170.

[4]Kishimoto H,Yoshito R.Cytokine and murine Coxsackievirus B3myocarditis:Interleukin-2 suppressed myocarditis in the acute stage but enhanced the condition in the subsequent stage[J].Circulation,1994,89:2836-2842.