生存素在大肠癌中的表达及意义

陈茹芬 杨清绪 李旭艳

1 广东惠州中心医院核医学科（516001）

2 广东惠州中心医院病理科（516001）

3 广东惠州中心医院检验中心（516001）

生存素（survivin）是新近发现的凋亡抑制蛋白（IAP）家族中新的一员,其抗凋亡作用的机制可通过caspase途径和非caspase途径实现[1]，是目前人类IAPs家族中研究最多的一个基因。研究已证实多种常见肿瘤如胃癌、大肠癌、乳癌、肺癌、肝癌等均存在survivin异常表达[2]，但在正常成人组织不表达或呈低表达。本文采用RT-PCR法检测大肠癌及癌旁组织中survivin mRNA表达情况，并探讨了生存素的表达与大肠癌临床病理的关系。

1 资料与方法

1.1 临床病例

选取惠州中心医院2008年8月至2009年11月经病理组织学诊断为大肠腺癌50例（男35例，女15例），平均56.8岁（36～70岁）；术后病理证实乳头状腺癌为15例，管状腺癌为13例，黏液腺癌为15例，印戒细胞癌为7例；按分化程度高分化腺癌25例，中分化腺癌15例，低分化腺癌10例；按Dukes'临床分期，A期10例，B期22例，C期18例。在手术中采集癌旁组织标本（距肿瘤边缘5cm处）30例正常大肠组织作为对照。

1.2 检测方法

1.2.1 主要试剂与仪器

兔抗人survivin多克隆抗体、DAB显色剂购自福州迈新生物技术开发公司，SP试剂盒购自武汉博士德，Trizol试剂购自Invitrogen公司，survivin基因引物由北京奥克公司合成。紫外凝胶显像仪（美国），Nikon Eclipse E1000采图摄像系统（日本）。

1.2.2 RT-PCR法检测生存素mRNA的表达

①取液氮保存的组织50～100mg，按Trizol说明书提取组织中的总RNA。②cDNA合成 取待测RNA 2μg，100ng/μL随机引物1μL，加水至20μL，70℃变性5min，冷却后再加入Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶1μL，5×逆转录缓冲液8μL，0.1MDTT 4μL，10mmol/L dNTPs 2μL，RNA酶抑制剂（Rnasin）20U，加水至终体积40μL，37℃加热1h，冷却后即完成cDNA的合成。③PCR反应：采用50μL的反应体系，其中包括：10×缓冲液，MgCl 21.5～2mmol/L引物各12.5pmol/L，Tag聚合酶1.5U，逆转录产物β2微球蛋白为3μL，生存素为5μL。所用β2微球蛋白引物序列：上游引物为5-CTCGC GCTAC TCTCT CTTTC-3’；下游引物为5’-CATGT CTCGT TCCCA CTTAA C-3’，扩增产物大小为330bp。所用生存素的引物序列：上游引物为5’-TTGAA TCGCG GGACC CGTTG G-3’；下游引物为5’-CAGAG GCCTC AATCC AT-GGC A-3’，扩增产物大小为528bp。扩增条件：β2MG 94℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共扩增28个循环，最后72℃再延伸7min；生存素为94℃预变性5min，然后94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸1min，共扩增32个循环，最后72℃再延伸7min。所有扩增均在GeneAmp System 9600热循环仪上进行。扩增产物在含0.5mg/L溴乙锭、20g/L的琼脂糖凝胶上电泳分离，在凝胶成像仪（VILBER LOURMAT）上对产物扫描，应用分析软件作相对半定量分析，在同一块凝胶上以生存素mRNA表达的吸光度值除以β2微球蛋白mRNA表达的吸光度值表示，阳性标准以大于癌旁正常组织产物表达的平均相对值界定。

1.2.3 免疫组织化学检测组织中survivin蛋白表达

组织经10%中性甲醛液固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，二甲苯脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，热抗原修复20min，正常马血清封闭，室温孵育10min。1∶200 survivin一抗4℃过夜，PBS洗片5min×3次，滴加生物素标记二抗，辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，脱水、透明、封片。用已知阳性肺癌切片为阳性对照切片，常规抗体稀释液代替一抗作为阴性对照。

1.3 统计学处理

采用SPSS12..0统计软件包进行统计学分析，采用，t检验、χ2检验，P＜0.05为差异有显著意义。

2 结 果

2.1 survivin在大肠癌和癌旁组织的表达

60例大肠癌组织survivin mRNA阳性表达40例（66.6%）明显高于癌旁组织2例（6.6%）（χ2=6.85，P＜0.01）。

2.2 免疫组织化学结果

60例大肠癌组织survivin mRNA阳性表达40例（66.6%）明显高于癌旁组织2例（6.6%）（χ2=6.85，P＜0.01）；且survivin表达与病理分级、有无淋巴结转移密切相关（χ2=4.25，χ2=4.85，P＜0.01；r=5.12，r=5.32，P＜0.05）；而survivin的表达与性别、年龄、癌组织的病理分型没有统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 survivin在大肠癌组织中表达与临床病理参数之间的关系

3 讨 论

生存素（survivin）是1997年耶鲁大学的Aitieric等[3]在人类基因组库中首先筛选分离出来的IAP（凋亡抑制蛋白）家族的一个新成员。在胚胎和胸腺组织中丰富表达，在人类大多数肿瘤亦存在高表达。大多数研究均认为，生存素除了在胚胎发育过程中和绝大多数肿瘤组织中表达外，在正常组织中不表达[4]。本研究采用较为敏感的RT-PCR方法检测大肠癌及癌旁正常组织中生存素mRNA的表达，结果大肠癌组织中阳性表达率（66.6%）明显高于癌旁正常组织（6.6%），这与Sarela等[5]的研究结果一致，表明生存素是一个较为特异的肿瘤标志物。分析survivin表达与大肠癌的主要参数的关系，发现survivin的表达与性别、年龄、病理类型等无明显关系，与病理分级、有无淋巴结转移密切相关。Survivin在病理分级低的组中及有淋巴结转移组阳性表达率均高于病理分级高的组及无淋巴结转移组，提示survivin的表达可能会影响大肠癌细胞的生物学特性，使其更容易浸润周围组织，发生局部转移、远处转移等恶性行为，也可能是预后不良的指征。生存素mRNA的表达与肿瘤患者的预后相关，这已在非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌中得到证实[6,7]。在大肠癌的研究中，Sarela等[5]的研究表明，在Ⅱ期大肠癌中生存素mRNA阴性表达组患者的5年生存率（94.4%）远高于阳性表达组（44.8%），提示Ⅱ期大肠癌术后检测生存素mRNA或生存素蛋白可作为评价大肠癌预后的客观指标。近来，一些体内、外试验研究表明[8]，在生存素阳性表达的细胞株或患者中，对化疗或放疗抵抗现象（chemo-radioresistance）普遍，而封闭生存素的表达则会增加肿瘤对放、化疗的敏感性。因此，从临床角度讲，生存素阳性表达的肿瘤患者其治疗效果可能不佳，化疗耐药现象可能和一些凋亡抑制基因如生存素有关。

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[3]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8):917-919.

[4]徐晓,陈卫昌,刘强,等.生存素在大肠癌中的表达及其与血管生成的关系[J].江苏医药,2005,31(6):439-442.

[5]Sarela AI,Macadam RC,Farmery SM,et al.Expression of the antiapoptosis gene,survivin,predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J].Gut,2000,46(12):645-650.

[6]Krieg A,Mahotka C,Krieg T,et al.Expression of different survivin variants in gastric carcinomas: first clue to a role of survivin-2B in tumour progression[J].Br J Cancer,2002,86(5):737-743.

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