猪血浆蛋白粉中IgG含量的酶联免疫检测方法研究

刘中勇 马孝斌 高东微 刘 津 王雅静

血浆蛋白粉(Spray-dried Plasma Protein,SDPP)是利用现代生物技术和加工手段，对新鲜血液进行抗凝处理和分离，将血浆从血液中分离出来，再进行压缩和低温保存，然后采取特殊的工艺进行喷雾干燥，最后制成乳白色或浅褐色的粉末状产品[1-2]。由于血浆蛋白粉含有丰富的营养物质，其作为一种新型、高效、安全的功能性蛋白质饲料，在断奶仔猪饲养中已经成为必不可少的蛋白饲料。

血浆蛋白粉目前还无统一质量标准，但已形成业内认可的检测指标，如感官检测、显微镜分析、水溶性检测、常规指标检测、凝胶实验及免疫球蛋白IgG定量检测[3]。其中IgG的检测基层使用的主要是免疫单扩散法，该方法耗时长，一般需要1～2 d才能出结果，重复性也差[3]。而作为国家标准的液相色谱方法由于仪器及检测成本较高，在基层难以推广[4]。因此目前亟需一种快速检测方法解决这个问题。本研究通过制备猪IgG单克隆抗体，进行调试优化，建立了基于间接竞争酶联免疫原理的快速检测方法。

1 实验材料与方法

1.1 试剂

猪IgG、牛IgG、猪乳铁蛋白等参考标准品，弗氏完全和不完全佐剂、细胞培养液等均购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗为博奥森生物公司产品；四甲基联苯胺购自欣经科生物科技公司；其他常用有机试剂、无机试剂均为分析纯，由北京化学试剂公司提供。

1.2 材料和仪器

酶标板条、细胞培养板等（华美生物工程公司），MK3酶标仪（热电公司），振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），细胞培养箱（日本三洋），电子天平（德国赛多利斯），其余为实验室常规仪器。

1.3 实验动物及细胞株

Balb/c小鼠由中国科学院遗传研究所提供，SP2/0细胞株由北京望尔生物技术有限公司保存。

1.4 方法

1.4.1 抗猪IgG单克隆抗体的制备

将猪IgG标准品用pH值7.2 PBS溶解为1 mg/ml后，按照每只Balb/c小鼠100 μg的剂量与等量的弗氏佐剂混合后皮下多点免疫。初次免疫时佐剂为完全佐剂，其余为不完全佐剂。多次免疫后眼眶采血测定血清效价。以150 μg剂量加强免疫后取小鼠脾细胞按照常规方法进行细胞融合，筛选强阳性细胞株后以体内诱生法制备腹水，经饱和硫酸铵法纯化后，测定其灵敏度，筛选适合于本研究的目标抗体及细胞株。

1.4.2 酶标板的制备及抗原抗体工作浓度的选择

将猪IgG用PBS配制为1 mg/ml的储存液后，以PBS 按 照 1： 10、1： 50、1： 100、1： 500、1： 1000、1： 3000稀释后，每孔加入100 μl，室温静置2 h后，4℃过夜后甩掉孔内液体，再加入封闭液（0.05 mol/l pH值 9.5的碳酸盐缓冲液，每孔 100 μl），室温孵育2 h，PBST洗板3次，加入梯度稀释的单克隆抗体后，按照常规ELISA反应操作，测定吸光度值，确定最优化的抗原抗体反应比例。

1.4.3 ELISA检测程序

按照间接竞争酶联免疫法的原理[5]，以一步法进行ELISA反应，具体如下：将猪IgG标准品储备液稀释成 0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2 μg/ml后，以 50 μl每孔加入酶标板，然后加入50 μl以优化浓度比例稀释得到的单克隆抗体溶液，再加入3000倍稀释的羊抗鼠酶标二抗，37℃反应30 min。以PBS-T洗板3次。每孔加入100 μl显色底物液（TMB-过氧化氢溶液），37℃显色反应15 min，最后加入1 mol/l硫酸50 μl终止反应。在酶标仪上以450 nm读取各孔吸光度。

1.4.4 标准曲线及结果计算

对标准品重复3次ELISA测定，记录OD值。根据杨利国等所述的logit-log作图法，以logity=ln其中 B为0 μg/ml标准品吸光度值，B为其0它标准品吸光度值)计算值作为y轴，以标准品浓度对数(logC)作为x轴绘制标准曲线[5]。

1.4.5 方法性能评价

血浆蛋白粉等具有较好的水溶性，因此直接用缓冲液如PBS等进行溶解后配制成一定浓度就可以进行ELISA测定。本研究即以此进行样品处理，分别就方法的特异性、最低检测限、回收实验及精密度等指标进行评价。

2 结果

2.1 抗体的制备及筛选

测定免疫血清后，选择效价较高的小鼠进行细胞融合，得到了13株阳性细胞株，各细胞株所分泌抗体的灵敏度分别为0.1～0.5 μg/ml不等，为了使最终所建立的方法检测样品稀释度较低，准确率较高，特选择了灵敏度为0.3 μg/ml的抗体作为后续实验对象。

2.2 抗原抗体最佳工作浓度

根据前期设定的实验方案进行ELISA测定，结果如表1所示。

表1 抗原抗体最佳工作浓度

由表1可知，当抗原包被浓度为1：1000（即1 μg/ml），抗体稀释为 1： 5000 倍时，OD 值为 1.983，满足ELISA检测时空白标准品的吸光度值要求，且抗原、抗体稀释比例合适，固后续实验均按此浓度进行。

2.3 ELISA标准曲线

标准曲线绘制如图1所示，该回归曲线的线性相关系数为R=0.995，线性相关显著。

图1 本研究所建立的ELISA标准品测定曲线

2.4 方法性能评价

2.4.1 特异性

表2 方法特异性评估结果

分别以常见的猪源蛋白及牛源蛋白代替猪IgG测定其标准曲线，计算50%抑制浓度计交叉反应率，结果如表2所示。由表2可知，方法对于猪IgG外的其他蛋白质无显著交叉反应，特异性良好。

2.4.2 最低检测限

连续测定20份不含猪IgG的空白样品（见表3），以测定结果的平均值加上3倍标准差作为本方法的最低检测限。经计算，本方法的最低检测限为10 μg/g。

表3 方法最低检测限

2.4.3 回收率及精密度

取不含猪IgG的蛋白粉样品用猪IgG标准品以10（1%）、100（10%）、200 mg/g（20%）含量水平进行添加，每个添加浓度测定5个样品，每个样品测定3次，记录测定结果并计算回收率及变异系数，结果见表4。

表4 方法定量限、回收率及精密度测定

3 讨论

从方法的建立过程来看，制备特异性好、灵敏度合适的单克隆抗体最为关键。猪IgG是大分子蛋白，免疫原性好，经过2次免疫后就得到了较高的血清效价。为了使最终产生的抗体稳定性更好，最终选择4次免疫后融合细胞。第一次筛选中细胞阳性率较高，但在后续筛选时部分丢失，原因不明。由于血浆蛋白粉中IgG含量一般在1%～25%，其对检测方法的灵敏度要求不高，所以最终选择了灵敏度为0.3 μg/ml的单克隆抗体。

双抗体夹心ELISA法是检测大分子蛋白常用的方法，其建立过程复杂，需要筛选两个针对不同抗原表位的抗体。本研究选择以间接竞争ELISA为原理，只需要筛选出一个合适的抗体。基于不需要太高灵敏度的前提，方法建立过程大大简化。

猪血浆蛋白粉作为优质的蛋白饲料，在断奶仔猪的饲养中非常重要。IgG作为其营养指标，测定技术也较多，尤其是免疫单扩散法在血浆蛋白粉生产企业中应用广泛。单扩法优点在于所用试剂简单，无须特殊仪器，其缺点是耗时长，重复性差，定量效果差，这与企业测定IgG含量的出发点相冲突。GB/T21033—2007所规定的HPLC方法测定时耗费试剂、耗材、仪器等，费用昂贵。其中单个Hi-Trap亲和柱价格在万元左右，而HPLC仪器本身价格国产的需要十多万元，在基层难以推广应用。

本研究所建立的间接竞争酶联免疫法是基于抗猪IgG单克隆抗体，具有特异性好，测定范围广的特点，基本满足了猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定，尤其是检测时间仅需要45 min，能同时检测42个样品（双孔平行对照），在基层检测中有广泛的应用前景。

[1]程忠刚.血浆蛋白的研究进展及其应用[J].中国饲料,1998(12)：20-21.

[2]陈冬星,成国辉,俞湘麟，等.添加喷雾干燥的血浆蛋白粉饲喂仔猪试验[J].中国畜牧杂志，2000(5)：36-37.

[3]刘娜.浅谈血浆蛋白粉质量评定[J].饲料博览,2007,17:45-47.

[4]GB/T 21033—2007饲料中免疫球蛋白IgG的测定-高效液相色谱法[S].中华人民共和国国家标准,2007.

[5]杨利国,胡少昶,魏平华，等.酶免疫测定技术[M].南京:南京大学出版社，1998.