婴幼儿腹泻病杯状病毒感染分析

胡记妹，黄绰妤，曾军荣，杨怀秀

（广东省广州市从化市中心医院检验科，广东广州 510900）

己有研究证明我国婴幼儿中存在诺瓦克样病毒 （Nomvalk-like virus，NLV）和札幌样病毒（Sapporo-like virus， SLV）两种人类杯状病毒（human calicivirus，HuCV）的感染，近年来我国杯状病毒性腹泻发生率呈上升趋势，己在多个地区发生暴发流行[1]；由于不能早期干预，一些婴幼儿由杯状病毒感染引起损害及危及生命，给家庭及社会带来巨大损失。从化地区是广州的县级城市，50多万人口，周边地区有众多民工，人口聚集，极易暴发流行各病毒感染。2005年1月～2007年12月笔者在从化地区用RT-PCR方法检测了非细菌性腹泻病患儿粪便标本的杯状病毒，分析从化地区婴幼儿杯状病毒性胃肠炎的流行情况。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2005年1月～2007年12月，我院门诊与住院诊治的6 678名0～7岁就诊腹泻患儿，男3 361名，女3 317名。

1.2 标本采集

2005年1月～2007年12月在广东省广州市从化巿中心医院住院部和门诊部儿科采集婴幼儿非菌性腹泻粪便标本。

1.3 检测前准备工作

粪便标本处理：加入1 ml样品稀释液（sample diluent）至1.5 ml EP管中，加入0.1 g固体粪便标本或0.1 ml液体粪便标本，置于漩涡震荡器混匀，室温静置10 min，室温下≥5 000 r/min离心5 min，备用。

1.4 病毒RNA提取

1.4.1 提取前的准备工作 ①将1 ml Buffer AVL加入装有低压冻干的Carrier RNA中，彻底溶解Carrier RNA后，将溶有Carrier RNA的Buffer AVL转入至Buffer AVL瓶中，彻底混匀。分装贮存于2～8℃。如果在2～8℃时，Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀，可在80℃重新溶解，注意加热的时间不能超过5 min，用前冷却至室温。Buffer AVL/Carrier RNA溶液不能加热超过6次。②加入合适比例的96%～100%的酒精至Buffer AW1中，19 ml的Buffer AW1加入酒精25 ml。③加入合适比例的96%～100%的酒精至Buffer AW2中，13 ml的Buffer AW2加入酒精30 ml。

1.4.2 病毒RNA的提取 ①在1.5 ml EP管中加入560μl已加入Carrier RNA的Buffer AVL。②将140μl 10%便悬液加入至EP管中的Buffer AVL中，vortex混匀15 sec。③室温（15～25℃）孵育10 min。④将1.5 ml EP管轻微离心，以去除管内的液滴。⑤在管内加入560μl 96%～100%的酒精，vortex混匀15 sec。混匀后，将1.5 ml EP管轻微离心，以去除管内的液滴。⑥小心地将630μl步骤⑤中的溶液加入至已放入2 ml收集管中的QIAamp离心柱中，注意不要弄湿柱子边缘。盖上盖子，8 000 r/min离心1 min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2 ml收集管中，弃去包含有滤过液的收集管。⑦小心打开QIAamp离心柱的盖子，重复步骤⑥。⑧小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入500μl Buffer AW1。盖上盖子，8 000 r/min离心1 min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2 ml收集管中，弃去包含有滤过液的收集管。⑨小心打开 QIAamp离心柱的盖子，加入 500μl Buffer AW2。盖上盖子，14 000 r/min离心3 min。弃去收集管中的滤过液，14 000 r/min离心空柱子1 min。⑩将QIAamp离心柱放置入干净的1.5 ml离心管中。弃去包含有滤过液的收集管。小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入60μl Buffer AVE至离心柱中，盖上盖子，室温孵育1 min。8 000 r/min离心1 min。（2×40μl的Buffer AVE洗脱 2次，能增加产量。）病毒 RNA进行反转录，或贮存于-20℃或-70℃备用，所用引物序列参见文献[2]。

2 结果

2.1 HuCV感染情况分布

6 678名0～7岁腹泻患儿中898例大便检测出HuCV，检出率为13.45%，见表1。

表1 2005年1月～2007年12月小儿腹泻HuCV感染情况分布（例）

2.2 不同性别、年龄与HuCV感染的关系

在3 361例男性腹泻患儿中有455例HuCV阳性，占13.54%，3 317名女性腹泻患儿中有443例HuCV阳性，占13.36%，各年龄组患儿的大便均检测出HuCV，以6个月～3岁年龄组分布较多，见表2。

表2 小儿腹泻HuCV感染年龄及性别分布情况

3 讨论

近年来随着分子生物学技术的发展，病原检测手段不断提高，国外文献对人类杯状病毒与疾病的关系已有较全面的研究报道，目前认为是除轮状病毒外造成腹泻的最重要的病毒病原；在我国对轮状病毒感染的研究较多，轮状病毒感染是婴幼儿非细菌性腹泻的主要病原，发展中国家每年有60万～70万名儿童死于重型轮状病毒腹泻[3-6]。本资料结果显示：0～7岁腹泻患儿的大便HuCV阳性率为13.45%；与文献报道相一致[7]。HuCV流行的一般特点：HuCV存在多种传播途径，即人-人传播、食物传播、水源传播，其中人-人传播又可分为粪-口传播和呕吐物的气溶胶传播[8]。由于HuCV感染剂量低（＜100病毒颗粒）、缺乏持续的免疫力且人群对HuCV普遍易感、存在多种潜在传播途径等，导致HuCV感染极易形成暴发。

HuCV感染在10～12月期间发生率较高，达694例，占77.28%以上，与其他时间段差异显著。HuCV感染在6个月～3岁为高峰期，与其他组比较差异显著。可能与婴幼儿期的喂养方式有关：6个月以内的婴儿多为母乳喂养，母乳中存在HuCV抗体、胰蛋白酶抑制剂、非免疫球蛋白性病毒抑制剂[9]，不易感染HuCV，且母乳喂养儿肠道中存在着一定数量的细菌群，主要是双歧杆菌，肠道正常菌群的存在能抑制HuCV的感染；另外婴幼儿期体内来自母体的获得性抗体在6个月以后渐渐消失，而自身的免疫系统尚未建立，机体对HuCV抵抗力减弱有关，所以发生率较高。6岁以后，随着自身的免疫系统的建立，机体对HuCV抵抗力增强，发生率显著降低。

HuCV腹泻患儿的临床资料分析表明，HuCV感染的临床症状与轮状病毒相似，以腹泻为主，约半数患儿伴有呕吐，并有不同程度的发热和腹痛等症状，部分患儿存在轻度到中度脱水，未发现严重脱水，均未见抽搐、休克等严重并发症。检测结果也表明广州地区婴幼儿腹泻病主要是杯状病毒，杯状病毒已成为继轮状病毒之后婴幼儿腹泻的重要病原体，分型引物RT-PCR法能够快速进行杯状病毒分组和鉴定，广泛适用于杯状病毒分子流行病学研究，为更好地预防和控制杯状病毒腹泻提供依据。

[1]陈冬梅,张又,钱渊,等.我国婴幼儿中存在不同基因型杯状病毒的感染[J].病毒学报,2001,17(3):265-269.

[2]Jiang X,Huang PW,Zhong WM,et al.Design and evaluation of a primer pair that detects both Norwalk and Sapporo-like caliciviruses by RT-PCR[J].JVirol Method,1999,83(3):145-154.

[3]Class RI,Bresee JS,Turclos R,et al.Rotavirus vaccines:targeting the developing world[J].JInfect Dis,2005,192(Suppl 1):S160-166.

[4]Kapikian AZ,Hoshino Y,Chanock RM,et al.Fieldsvirology[M].4th ed.Philadelphia:Lippincott-Paven,2001:1783-1833.

[5]Widdowson MA,Bresee JS,Gentsch JR,et al.Rotavirus disease and its prevention[J].Curr Opin Gastroentero,2005,21(1):26-31.

[6]曲梅,杨文,董建红.秋冬季婴幼儿腹泻206例临床分析[J].齐鲁医学杂志,2004,19(4):347-348.

[7]Ksnipe DM,Howley PM.Fields Virology[M].4th ed.Philadelphia:Lippincott-Raven Publishers,2001:841-874.

[8]焦富勇,康华,王可胜,等.小儿轮状病毒感染性腹泻研究进展[J].国外医学:妇幼分册,2002,13(1):42-44.

[9]张丽杰,杜曾,章青,等.昆明市儿童医院1998～2001年轮状病毒哨点检测分析[J].中华流行病学杂志,2004,25(5):396-399.