La(C7H 5O3)2·(C9H 6NO)抑制 Hela 细胞生长作用机制研究

张 辉 ，喻莉萍 ，李 旭 ，胡吉林 ，何志雄 ，林应标 ，刘巧突 ，李强国

（1.湘南学院化学与生命科学系药学教研室，湖南郴州 423000；2.湘南学院图书馆，湖南郴州 423000；3.湖南省郴州市第一人民医院检验科，湖南郴州 423000）

La(C7H5O3)2·(C9H6NO)是将七水氯化镧与水杨酸、8-羟基喹啉反应合成的镧与水杨酸、8-羟基喹啉三元混合配合物，为一种人工合成的稀土配合物。水杨酸是常用的抗感染药物[1]，喹啉衍生物则具有较好的抗菌、抗肿瘤作用[2]，稀土和许多生物分子有亲和力，并能参与重要的生命过程，对多种酶或酶原具有激活或抑制作用，有明显的抗菌活性[3]。我室最近的研究显示，该配合物具有抗真菌和细菌的作用[4]，也具有促细胞凋亡作用[5]。然而La(C7H5O3)2·(C9H6NO)促凋亡的作用机制尚不清楚。本研究通过探讨La(C7H5O3)2·(C9H6NO)对Hela细胞生长状态的影响及其作用机制，旨在阐明La(C7H5O3)2·(C9H6NO)是否通过阻滞肿瘤细胞周期而选择性地诱导凋亡以抑制细胞增殖。

1 材料与方法

1.1 材料

Hela细胞购自中国医科大学细胞生物学教研室，七水氯化镧（上海试剂公司，分析纯），水杨酸（上海试剂公司，分析纯），8-羟基喹啉（上海试剂公司，分析纯），AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒为北京宝赛生物技术有限公司生产，RPMI 1640 培养基为 GIBCO-BRL（Grand Island，NY，USA）公司产品。

1.2 方法

1.2.1 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)溶液的 配制 将 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)溶于 DMSO溶液中，配制成 1 g/L的母液，贮存于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 Hel a细胞的培养条件[6]Hela细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃、50 ml/L CO2条件下培养。实验时细胞处于对数生长期，活细胞数超过95%，在含1%胎牛血清的RPMI 1640中饥饿培养24 h后，于培养瓶中分别加入含不同实验浓度的 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)（0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L）的培养液，分别在24 h及48 h换同样浓度的加药培养液，以未加La(C7H5O3)2·(C9H6NO)干预的细胞为对照组。

1.2.3 MTT法测定La(C7H5O3)2·(C9H6NO)对Hel a细胞增殖活性的影响 根据以往文献[7]，96孔板细胞接种密度为每孔2×103个，24 h 后加入实验浓度 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)培养液，选择 570 nm 波长，在加药前和加药后 24、48、72、96 h分别测定光吸收值A。实验结束后，计算细胞生长率。生长率=（A处理细胞-A未处理细胞）/A未处理细胞×100%。 实验重复 3 次，取平均值进行分析。

1.2.4 FCM检测细胞周期 细胞传代24 h后，在含1%胎牛血清的RPMI 1640中饥饿培养24 h后，加入实验浓度的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)培养液，72 h后收集细胞，根据以往文献方法[8]检测细胞周期。实验重复3次，取平均值进行分析。

1.2.5 Annexi nⅤ-FITC细胞凋亡检测[9]收集La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用72 h的细胞，调整细胞浓度为1 000个/L，PBS洗涤2次，取1 ml细胞悬液按照试剂盒说明进行凋亡检测。AnnexinⅤ阳性且PI阴性判断为早期凋亡。实验重复3次，取平均值进行分析。

1.3 统计学分析

结果以均数±标准差（x±s）表示，经SPSS 12.0软件分析，采用方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 La(C7H5O3)2·(C9H 6NO)对细胞增殖的影响

5.0 、10.0 μmol/L 的 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)处理 72 h 后，Hela细胞的生长增殖活性开始受到抑制；处理96h后，1.0μmol/L的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)也能抑制Hela细胞的生长增殖活性。结果表明，随着La(C7H5O3)2·(C9H6NO)浓度的增加及作用时间的延长，其抑制作用显著增强，呈浓度及时间依赖效应。见表1。

表1 不同浓度的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)在不同时点对Hela细胞生长率的影响（x±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of La(C 7H5O3)2·(C9H6NO)in different times on the growth rate of Hela cells(x±s,%)

2.2 La(C7H5O3)2·(C9H 6NO)对细胞周期的影响

Hela 细胞经 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用 72 h 后，1.0、5.0、10.0μmol/L组G0/G1期的细胞数量逐渐增多，S期细胞数量下降，与对照组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 Hela细胞经La(C7H5O3)2·(C9H6NO)处理72 h后细胞周期的变化（x±s，%）Tab.2 Changes in cell cycle of Hela cells treated with La(C7H5O3)2·(C9H6NO)for 72 hours(x±s,%)

2.3 AnnexinⅤ-FITC法检测细胞凋亡结果

La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用 96 h 后，1.0、5.0、10.0 μmol/L La(C7H5O3)2·(C9H6NO)组的凋亡率显著高于对照组（P＜0.01）。见表3。

表3 AnnexinⅤ-FITC检测La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用96 h后的Hela 细胞凋亡率的变化（x±s，%）Tab.3 Apoptotic rate of Hela cells treated with La(C7H5O3)2·(C9H6NO)for 96 hours detected by AnnexinⅤ-FITC staining(x±s,%)

3 讨论

许多用于癌症化疗的细胞毒药物最终的共同的作用机制都是引起细胞凋亡。各种不同作用靶点的药物可通过激活不同的信号传导通路，最后导致凋亡的发生[10-12]。

本研究结果表明，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)对 Hela细胞生长具有抑制作用，随着药物浓度由0.5μmol/L增至10.0μmol/L及作用时间由24 h增至96 h，Hela细胞生长抑制作用显著加强，呈浓度及时间依赖性。细胞周期分析显示，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)处理后 G0/G1期细胞数量显著增加，S期细胞数量显著下降，表明 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)可使 Hela细胞周期阻滞于G0/G1期。

由以上结果可以推断，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)除具有促凋亡作用外，还能抑制细胞分裂，可能提示La(C7H5O3)2·(C9H6NO)诱导的凋亡和细胞周期阻滞是通过不同的信号传导机制介导的，哪一种途径占优势取决于细胞特异的信号通路（细胞类型特异性）和信号受影响的程度（药物剂量依赖性）。基于上述各种原因，在经过La(C7H5O3)2·(C9H6NO)处理后，如果对凋亡信号的影响超过了对细胞周期信号的影响，则细胞将产生凋亡。反之，则引起细胞周期的阻滞；随着细胞周期阻滞的延长，最终会导致细胞凋亡，但这是通过不同的、间接的信号事件启动的，是细胞周期进程受到阻滞引起的结果。总之，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)可能通过阻滞细胞周期及诱导凋亡来抑制细胞增殖。

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