高效液相色谱法测定5′-三磷酸腺苷含量

5′-三磷酸腺苷 (Adenosine triphosphate,ATP)又名腺三磷、腺嘌呤配糖三磷酸，临床应用广泛，是用于治疗进行性肌萎缩、脑溢血后遗症、心机能不全、心肌疾患及肝炎等疾病的辅酶类药物，被称为人体内的“能量货币”[1]。

在ATP的制备、存储过程中，易混入或产生一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)等杂质。ATP、ADP及AMP的结构相似、理化性质相近，因此检测较为困难[2]。我国部标和地方标准均采用纸电泳法[3]或纸层析法[4]测定ATP含量，存在操作时间长、误差较大、操作繁琐的缺点。也有报道采用生物发光法测定ATP含量，但该方法不能对杂质进行分析[5]。作者采用高效液相色谱法测定ATP含量，结果令人满意。

1 实验

1.1 试剂和仪器

对照品：ATP二钠(Sigma)，ADP (中国医药上海化学试剂公司)，AMP(中科院上海生化所东风生化技术公司)；样品：ATP二钠(批号：200209070,上海太平洋制药厂)；NH3·H2O、磷酸二氢铵，分析纯。

Waters 600型高效液相色谱工作系统,PDA996型二极管阵列检测器；WFZ800-D2C型紫外可见分光光度计,北京瑞利分析仪器公司；PHS-3C型精密pH计,上海雷磁。

1.2 色谱条件

色谱条件为：XTerraTMRP18(3.9 mm×150 mm，5 μm) 色谱柱，检测波长259 nm，柱温(25±2)℃,流动相为0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4缓冲溶液，进样量20 μL，流速1.0 mL·min-1。

1.3 ATP含量的计算

按1.2条件测定ATP、ADP和AMP的HPLC谱图，样品中ATP的含量依下式计算：

式中：ξ为样品中ATP质量分数；VS为样品液体积；AL为对照品ATP峰面积；cL为对照品溶液中ATP浓度；WS为配制样品液中ATP质量；AS为样品ATP峰面积。

2 结果与讨论

2.1 波长的选择

配制0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4缓冲溶液，用该缓冲溶液配制0.009250 g·L-1ATP对照品溶液。以NH4H2PO4缓冲溶液为参比，对ATP溶液进行紫外扫描，结果见图1。

由图1可知，ATP在208 nm和259 nm处有大的吸收值。由于259 nm处波峰较宽、数据较为稳定，因此选用259 nm作为检测波长。

图1 ATP紫外扫描图谱

2.2 标准曲线的绘制

由于ATP、ADP、AMP在波长259 nm处都具有最大吸收且摩尔吸光系数相同，因此可用紫外分光光度法对其线性关系进行考察[6]。

准确称取ATP对照品0.008278 g，置于100 mL容量瓶中，用0.05 mol·L-1pH值7.0的NH4H2PO4缓冲溶液定容至刻度，摇匀作为ATP对照品溶液。精密量取ATP对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL,分别置5 mL容量瓶中,用NH4H2PO4缓冲溶液定容至刻度，摇匀。

以NH4H2PO4缓冲溶液为参比，测定各溶液259 nm处吸光度值A259。以A259为纵坐标、ATP浓度为横坐标绘制标准曲线，见图2。

图2 ATP标准曲线

由图2可知，ATP浓度在10～80 mg·L-1范围内与259 nm处吸光度值呈良好线性关系，拟合线性回归方程为：y=0.03508+24.2365x(R=0.9994)。

2.3 HPLC检测结果

在1.2条件下ATP对照品、ADP对照品、AMP对照品和ATP样品的HPLC检测结果如图3所示。溶液浓度均为20 mg·L-1。

图3 ATP、ADP和AMP的HPLC图谱

由图3可知，ATP、ADP、AMP的出峰顺序为ATP>ADP>AMP。主峰ATP峰的保留时间为1.4～1.5 min，较靠后的AMP峰的保留时间为3.2～3.3 min。此外，在ATP样品的HPLC谱图中还发现了一个Ado(腺苷)峰，其保留时间为5.6 min，该峰的出现可能与生产样品ATP的底物有关。整个色谱检测过程可在7 min内完成。

2.4 重复性实验

分别取ATP对照品、ADP对照品和AMP对照品的溶液各20 mg·L-1，重复进样3次，计算峰面积，RSD分别为0.81%、1.96%、1.28%。

2.5 方法的回收率

以20 mg·L-1的ATP对照品溶液作为外标溶液，精确量取两管(各5 mL)外标溶液，分别加入NH4H2PO4缓冲溶液和ATP样品溶液各5 mL，另取一管分别加入NH4H2PO4缓冲溶液和ATP样品溶液各5 mL，进行色谱分析，每管进样2次，计算得平均回收率为98.87%，RSD为1.02%。

2.6 样品测定

按1.2色谱条件，精确量取样品溶液和对照品溶液各20 μL，重复进样3次，测得ATP含量为95.6%，RSD为0.85%。

3 结论

采用高效液相色谱法测定5′-三磷酸腺苷含量。色谱条件为：XTerraTMRP18(3.9 mm×150 mm，5 μm) 色谱柱，流动相为0.05 mol·L-1pH值7.0 的NH4H2PO4缓冲溶液，检测波长259 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温(25±2)℃,进样量20 μL。在10～80 mg·L-1范围内，ATP浓度与259 nm处吸光度值呈良好线性关系，R=0.9994；检测重复性较好，平均回收率为98.87%，整个色谱过程可在7 min内完成。该方法也可用于ADP和AMP的分离检测。

参考文献：

[1] 程叙扬，李晓玫.细胞外三磷酸腺苷的代谢及其生物学作用[J].中国病理生理杂志，1998，14(4)：438-441.

[2] 陈燕敏，姜开余，陈幼亭．三磷酸腺苷溶液的稳定性考察[J]．苏州医学院学报，1997，17(1)：128，130．

[3] WS1-C3-0001-89,三磷酸腺苷二钠[S].

[4] GB 15356-94,生化试剂核苷酸测定[S]．

[5] Andreotti Peter E (Boca Raton.FL)．Device for measuring ATP[P]．USP 5 916 802,1999-06-29.

[6] 王龙耀，范利华，肖安风,等．ATP的分析方法综述[J]．天津化工，2003，17(2)：30-33．