谷胱甘肽电化学检测方法的研究

谷胱甘肽(GSH)是细胞内最丰富的低分子量巯基化合物，在人体代谢中发挥重要的作用，包括外源化学物质解毒作用、细胞稳态的维持、辐射防护和抗氧化等[1]；且GSH的消除与人体多种疾病密切相关，如糖尿病、艾滋病和神经退行性疾病等[2～4]。现已发展了多种GSH分析检测方法，如酶法[5,6]、荧光测定法[7]、高效液相色谱法等。但这些方法存在灵敏度和选择性较低、需要大型仪器及复杂耗时的柱前或柱后衍生[8～10]等缺陷；而电化学方法灵敏、简便、快速。

作者在此研究了铜(Ⅱ)和铬(Ⅵ)两种金属离子在金电极上的电化学响应与GSH浓度的关系，由此建立了一种灵敏、简便的GSH电化学检测方法。

1 实验

1.1 试剂及仪器

GSH，Sigma公司；其它试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

CHI760c型电化学工作站，上海辰华仪器公司；Mettler-Toledo DELTA 320型pH计，Mettler-Toledo Instruments(上海)Co.,Ltd.；三电极体系：裸金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。文中所有电位均相对于参比电极而言。

1.2 方法

在循环伏安(CV)法扫描前，溶液均通N2除氧15 min。将金电极先用Al2O3粉末抛光，再依次用Piranha溶液[V(浓H2SO4)∶V(30% H2O2)=1∶1]、丙酮水溶液[V(丙酮)∶V(水)=1∶1]、二次蒸馏水超声振荡清洗，放干待用。所有测定均在室温下进行。

1.3 GSH对铜(Ⅱ)在金电极上的电化学行为的影响

在+0.6～-0.5 V电位范围内，对硫酸铜浓度为2.0×10-4mol·L-1的磷酸缓冲溶液(0.1 mol·L-1,pH=5.6，NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液)以100 mV·s-1的扫描速度进行CV扫描，记录CV曲线。再加入不同浓度的GSH溶液在同等条件下进行CV扫描。

1.4 GSH对铬(Ⅵ)在金电极上的电化学行为的影响

参照文献[11]，分别配制0.02 mol·L-1、0.01 mol·L-1的K2Cr2O7标准溶液。准确量取K2Cr2O7标准溶液0.05 mL于5 mL量瓶中，用含0.001 mol·L-1H2SO4的0.1 mol·L-1NaNO3溶液加至刻度，摇匀，倒入10 mL烧杯中通N215 min，即为2.0×10-4mol·L-1和1.0×10-4mol·L-1的铬(Ⅵ)溶液。将铬(Ⅵ)溶液分别在三电极体系中扫描，记录CV曲线，电位范围为+0.8～-0.2 V,扫描速度为200 mV·s-1。再加入不同浓度的GSH溶液在同等条件下进行CV扫描。

2 结果与讨论

2.1 GSH对铜(Ⅱ)在金电极上的电化学行为的影响(图1)

1.2.0×10-4 mol·L-1铜(Ⅱ) 2.2.0×10-4 mol·L-1铜(Ⅱ)+1.0×10-9 mol·L-1 GSH

由图1可以看出，2.0×10-4mol·L-1铜(Ⅱ)在约0.28 V处出现了一个还原峰，当加入GSH溶液后，峰电流下降,见表1。

表1 不同浓度GSH对铜(Ⅱ)在金电极上峰电流的抑制

铜(Ⅱ)峰电流与1.0×10-8～8.0×10-8mol·L-1范围内的GSH浓度呈线性相关,见图2。

图2 GSH浓度与2.0×10-4 mol·L-1铜(Ⅱ)在金电极上的还原峰电流的线性关系图

其线性回归方程为y=-0.1321x+3.4262，R=0.9822，检测限为1.0×10-9mol·L-1。

随扫描速度(10 mV·s-1、20 mV·s-1、50 mV·s-1、100 mV·s-1、200 mV·s-1)的加快，2.0×10-4mol·L-1铜(Ⅱ)+7.0×10-4mol·L-1GSH溶液还原峰电流呈线性增加(图3)。表明铜(Ⅱ)在GSH存在下的电化学行为是一个受吸附控制的过程。

图3 2.0×10-4 mol·L-1铜(Ⅱ)+7.0×10-4 mol·L-1 GSH溶液在金电极上的还原峰电流与扫描速度的线性关系图

2.2 GSH对铬(Ⅵ)在金电极上的电化学行为的影响(图4)

1.2.0×10-4 mol·L-1铬(Ⅵ) 2.2.0×10-4 mol·L-1铬(Ⅵ)+1.0×10-11 mol·L-1 GSH

由图4可以看出，2.0×10-4mol·L-1铬(Ⅵ)在约0.25 V处出现了一个还原峰，当加入GSH溶液后，峰电流下降，见表2。

铬(Ⅵ)峰电流与1.0×10-11～7.0×10-11mol·L-1范围内的GSH浓度呈线性相关，见图5。

表2 不同浓度GSH对铬(Ⅵ)在金电极上的峰电流的抑制

图5 GSH浓度与2.0×10-4 mol·L-1铬(Ⅵ)在金电极上的还原峰电流的线性关系

其线性回归方程为y=-0.969x+8.357，R=0.9813，检测限为1.0×10-11mol·L-1。杨培慧等[11]报道在1.0×10-4mol·L-1的铬(Ⅵ)溶液中加入不同浓度GSH进行CV扫描，GSH检测限为1.0×10-9mol·L-1，线性范围为7.0×10-8～1.0×10-9mol·L-1，线性回归方程为y=-55.063x+5.216，R=0.9526。可见，加大铬(Ⅵ)的浓度，可显著提高GSH的检测限。

随扫描速度(200～1000 mV·s-1)的加快，1.0×10-4mol·L-1铬(Ⅵ)+2.0×10-5mol·L-1GSH溶液还原峰电流呈线性增加(图6)。表明铬(Ⅵ)在GSH存在下的电化学行为是一个受吸附控制的过程，与文献[11]报道结果一致。

3 结论

首次以铜(Ⅱ)的还原峰为信号，建立了GSH的间接检测方法;并通过增大铬(Ⅵ)的浓度，极大地提高了以铬(Ⅵ)的还原峰为信号的GSH间接检测方法的检测限。从而建立了一种灵敏、简便的GSH电化学检测方法。

图6 1.0×10-4 mol·L-1 铬(Ⅵ)+2.0×10-5 mol·L-1 GSH溶液在金电极上的还原峰电流与扫描速度的线性关系

参考文献：

[1] Halliwell B,Gutterridge J M C.In Free Radicals in Biology and Medicine(3rd ed)[M].Oxford:Oxford University Press,1999:163-179.

[2] Murakami K,Kondo T,Ohtsuka Y et al.Impairment of glutathione metabolism in erythrocytes from patients with diabetes mellitus[J].Metabolism,1989,38(8):753-758.

[3] Sprietsma J E.Cysteine,glutathione (GSH) and zinc and copper i-ons together are effective,natural,intracellular inhibitors of (AIDS) viruses[J].Medical Hypotheses,1999,52(6):529-538.

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[11] 杨培慧，赵秋香，蔡继业.铬(Ⅵ)存在下谷胱甘肽的电化学检测[J].中国生化药物杂志，2004， 25(5)：273-275.