吴茱萸次碱的合成、结构表征及体内抗肿瘤作用研究

癌症是威胁人类生命最严重的疾病之一。中药抗肿瘤药物的研究是在20世纪上半叶逐步形成和发展的，在恶性肿瘤引起死亡率呈上升趋势的今天，开发疗效显著、不良反应小的抗肿瘤新药具有重要意义，其中中药抗肿瘤新药具有广阔的前景[1]。

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实。味苦辛、性温热、有小毒，具有散寒止痛、降逆止吐、助阳止泻之功效，用于厥阴头痛、腹脘冷痛、呕吐泄泻、痛经、高血压等症[2]。吴茱萸含有多种生物碱、挥发油、苦味素等化学成分[3,4]，其有效活性成分吴茱萸次碱(Rutaecarpine)属于喹唑啉酮咔啉生物碱，具有良好的强心、降压、舒血管、利尿、镇痛、抗炎、降低血小板凝聚、松弛血管平滑肌及肛门括约肌等作用[5～9]。近年来，国内外已有一些吴茱萸次碱抗肿瘤作用的报道[10～12]，但是到目前为止，国内外学者的研究焦点主要集中于吴茱萸提取物的抗肿瘤活性，而对吴茱萸的有效单体化合物的合成及抗肿瘤活性研究很少，并且由于从吴茱萸中提取的有效成分含量很低，难于进行深入的研究。

作者以色胺和靛红酸酐为起始原料经三步反应合成吴茱萸次碱，通过元素分析、IR、质谱、1HNMR等对合成的目标化合物进行了表征。并考察了吴茱萸次碱对小鼠移植性肉瘤S180和肝癌H22的作用情况。吴茱萸次碱(化合物Ⅰ)的合成路线如下：

1 实验

1.1 试剂与仪器

色胺(98%)，J&K Chemical Ltd.；三氟乙酸酐(99%)、靛红酸酐(98%)，New Jersey USA:1-800-ACROS-01；注射用环磷酰胺(Cytoxan，CTX)，山西普德药业有限公司；其它常规试剂均为国产分析纯。

WRS-1A型数字熔点仪，上海物理光学仪器厂；Vario EL-Ⅲ型元素分析仪，德国；EQUINOX55型红外光谱仪(KBr压片)，德国Bruker公司；VARIAN INOVA 400 MHz型超导核磁共振仪，美国Varian公司；AXIMA-CFRTMplus型基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪，英国克雷斯托公司；Motic AE21型倒置显微镜；100级超净工作室，苏州；离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验动物和瘤株

昆明种小鼠[合格证号：SCXK(陕)2007-001]，西安交通大学医学院实验动物中心；小鼠S180肉瘤细胞、小鼠H22腹水型肝癌细胞，第四军医大学实验动物中心。

1.3 吴茱萸次碱的合成

1.3.1 化合物Ⅳ的合成

在装有回流冷凝管、温度计、滴液漏斗和磁子的三颈瓶中加入1.63 g(0.01 mol)靛红酸酐(化合物Ⅱ)和20 mL吡啶(干燥)，常温下滴加1.5 mL(0.01 mol)三氟乙酸酐和5 mL吡啶的混合溶液。搅拌1 h后，146℃加热回流1.5 h。然后滴加1.6 g(0.01 mol)色胺(化合物Ⅲ)和5 mL吡啶混合溶液，滴加完后回流1.5 h。冷却,倒入50 mL冰水中，静置50 h,析出灰白色沉淀。过滤，用少量氯仿洗涤3次，干燥，得到白色固体2.08 g。m.p.176～178℃(文献[13]值：178～180℃)。

1.3.2 化合物Ⅴ的合成

在装有回流冷凝管、温度计和磁子的三颈瓶中加入1.78 g(0.005 mol)化合物Ⅳ、10 mL乙酸和2 mL盐酸，加热搅拌回流1.5 h。冷却，加入50 mL冰水，静置24 h，析出灰色沉淀。过滤，用少量乙醇洗涤3次，干燥，得到白色粉末状晶体1.3 g。m.p.268～269℃(文献[14]值：270℃)。

1.3.3 吴茱萸次碱的合成

在装有回流冷凝管、温度计和磁子的三颈瓶中加入0.5 g NaOH和3 mL水，搅拌至NaOH溶解后，加入8 mL乙醇，加热搅拌，慢慢加入1.07 g(0.003 mol)化合物Ⅴ，130℃回流1.5 h，冷却,倒入100 mL冰水中，静置48 h,析出灰褐色沉淀。过滤，用10 mL氯仿和甲醇的混合溶剂(1∶1)重结晶，得到浅黄色固体0.62 g。m.p.260～262℃(文献[15]值：258～259℃)。

1.4 抑瘤实验[16,17]

实验动物随机分为5组：阴性对照组(蒸馏水20 mL·kg-1)，阳性CTX组(20 mg·kg-1)，吴茱萸次碱高、中、低剂量组(20 mg·kg-1、10 mg·kg-1和5 mg·kg-1)。选取移植肿瘤7 d、肿瘤生长良好、腹部膨隆明显的小鼠，在超净工作台内，进行腹部皮肤消毒。用一次性无菌采血器经腹壁刺入腹腔，抽取腹水，放入无菌试管中，从中抽取0.1 mL以生理盐水稀释50倍，用细胞计数板在显微镜下计数，调细胞浓度为1×107个·mL-1。于每只实验小鼠右侧腋部皮下接种0.2 mL。各组动物于接种肿瘤次日随机分组(H22每组10只，S180每组12只)并开始灌胃给药。每日1次，连续给药10 d。给药结束次日，将动物称重后脱颈椎处死，剥离出皮下瘤块，并取出脾脏和胸腺，称重，比较各组间肿瘤质量的差异性。按照下列公式计算抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数。

脾脏指数=脾脏平均质量(mg)/小鼠平均质量(g)

胸腺指数=胸腺平均质量(mg)/小鼠平均质量(g)

2 结果与讨论

2.1 元素分析(表1)

表1 中间化合物和吴茱萸次碱的颜色及元素分析

由表1可见，各化合物的元素分析实测值和理论值基本相符。

2.2 红外光谱分析

以KBr为基质，在4000～400 cm-1范围内测定吴茱萸次碱的红外光谱,见图1。

图1 吴茱萸次碱的红外光谱图

由图1可见，吴茱萸次碱在3339 cm-1处出现N-H的伸缩振动吸收峰，在1655 cm-1处出现C=O的特征吸收峰，在1545 cm-1处出现C=N的特征吸收峰，在1598 cm-1、1461 cm-1、731 cm-1出现苯环的特征吸收峰，与文献[18]报道的一致，说明已成功合成目标化合物。

2.3 质谱及核磁共振氢谱分析

吴茱萸次碱的质谱图(CDCl3为溶剂)和1HNMR(CDCl3为溶剂)谱图见图2和3。

图2 吴茱萸次碱的质谱图

由图3可见，吴茱萸次碱的1HNMR图谱中存在6种不同环境的氢，分别归属为：11.87(s,1H,N-H)，8.31(d,1H)，7.79(t,1H)，7.65(d,1H)，7.52(d,1H)，7.41(t,1H)，7.26(t,1H)，7.10(t,1H)，4.59(t,2H)，3.25(t,2H)，这与文献[18]报道的一致。且质谱最高强度峰为吴茱萸次碱的分子量，进一步证实已成功合成目标化合物。

图3 吴茱萸次碱的1HNMR谱图

2.4 抗肿瘤活性

2.4.1 吴茱萸次碱对移植S180小鼠的影响(表2)

表2 吴茱萸次碱对移植S180小鼠的影响

由表2可见,与阴性对照组比较，吴茱萸次碱高、中、低剂量给药组瘤体质量都有所降低，平均抑瘤率分别为42.83%、41.05%、37.55%。说明吴茱萸次碱对瘤体生长有一定的抑制作用。但吴茱萸次碱给药组的平均抑瘤率低于阳性CTX组，说明吴茱萸次碱对S180移植瘤瘤体生长的抑制作用不如环磷酰胺。阳性CTX组与阴性对照组相比，小鼠的脾脏指数和胸腺指数有所降低，且有统计学意义(P<0.05),表明环磷酰胺有损伤免疫器官的作用。而吴茱萸次碱各给药组能明显增加小鼠脾脏指数(P<0.05)，对胸腺指数影响不明显，提示吴茱萸次碱能够保护免疫器官，增强免疫力。

2.4.2 吴茱萸次碱对移植H22小鼠的影响(表3)

表3 吴茱萸次碱对移植H22小鼠的影响

由表3可见,与阴性对照组比较，吴茱萸次碱高、中、低剂量给药组瘤体质量都有所降低(P<0.05),平均抑瘤率分别为43.83%、43.53%、35.03%。说明吴茱萸次碱对瘤体生长有一定的抑制作用。但吴茱萸次碱给药组的平均抑瘤率低于阳性CTX组，说明吴茱萸次碱对H22移植瘤瘤体生长的抑制作用不如环磷酰胺。而阳性CTX组与阴性对照组相比，小鼠的脾脏指数和胸腺指数有所降低，且有统计学意义(P<0.05)，表明环磷酰胺有损伤免疫器官的作用。而吴茱萸次碱作用移植H22小鼠后，脾脏指数略有下降，虽然对免疫器官有损伤，但比环磷酰胺的损伤作用小。

3 结论

吴茱萸是一种药效明确的天然植物，吴茱萸次碱作为其主要活性成分，对小鼠移植性肿瘤S180和H22瘤体生长均具有抑制作用，且它们作用肿瘤小鼠后对脾脏指数和胸腺指数影响较小，甚至有增加作用。因此，吴茱萸次碱是吴茱萸抗肿瘤活性的物质基础，作为抗肿瘤药物具有极大的开发潜力。

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