L-精氨酸助溶菌酶复性过程动力学研究

随着基因工程领域的研究和发展，外源蛋白在大肠杆菌(E.coli)内的克隆与表达已不再困难，通过细胞培养大量生产对人类有重要价值的蛋白质已成为可能。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是原核表达体系，还是真核表达体系甚至高等真核表达体系，都容易形成没有生物活性的包涵体，这主要是因为在重组蛋白的大量表达过程中，缺乏某些蛋白质正确折叠所需要的酶和分子伴侣等，或因环境不适无法形成正确的次级键等[1]。从包涵体中获得有活性的蛋白，必须进行体外复性。蛋白质复性技术对于重组蛋白的大规模生产具有重要意义，其中稀释复性是一种最常见的蛋白质复性方法。

实现蛋白质复性首先需要提供能使蛋白质以能量最低状态存在的溶液环境，其次在操作过程中需抑制蛋白质聚集体的生成[2]。蛋白质折叠过程中存在两种疏水作用，即分子内和分子间疏水作用。前者促进蛋白质正确折叠成天然活性态，而后者导致变性蛋白质发生不可逆聚集和沉淀[3]。稀释复性过程中往往由于聚集体的生成而严重影响复性收率。抑制蛋白质肽链之间的聚集作用、提高变性蛋白质的复性收率成为当前蛋白质复性研究的焦点。为了抑制变性蛋白质分子间的疏水作用、提高蛋白质复性收率，体外复性时添加辅助因子是其有效方法之一[4]。

L-精氨酸(L-Arginine，简称L-Arg)具有成本低廉、性质稳定等优点，对某些蛋白质的复性有很好的促进作用[5，6]，特别是对一些含二硫键的变性蛋白[7]或某些重组蛋白的体外复性[8，9]，添加L-精氨酸能很好地提高其蛋白复性收率[7]。但是，L-精氨酸促进蛋白质复性过程特性的分析和研究很少[6，7，10]，特别是未见其复性过程动力学模型的研究报道。

作者利用变性蛋白质复性研究中提出的复性和聚集竞争反应机制[11]，以溶菌酶为模型蛋白，研究了L-精氨酸助溶菌酶复性的最佳条件和表观动力学，并讨论L-精氨酸助复性的可能机理，为下一步基因工程重组蛋白的复性研究打下基础。

1 实验

1.1 试剂

溶菌酶，碘乙酸 (Sigma,USA),二硫苏糖醇(DTT)，氧化型谷胱甘肽(GSSG)，还原型谷胱甘肽(GSH)，L-精氨酸，三羟基氨基甲烷(Tris)，尿素(进口分装，上海源聚生物科技有限公司)。

变性缓冲溶液为pH值8.6的0.1 mol·L-1Tris-HCl,含8 mol·L-1尿素、30 mmol·L-1DTT和1 mmol·L-1EDTA。

基础复性缓冲溶液为pH值8.2的0.1 mol·L-1Tris-HCl,含0.4 mmol·L-1GSSG、4 mmol·L-1GSH和1.0 mmol·L-1EDTA。用该缓冲溶液配制不同浓度的L-Arg复性缓冲溶液，备用。

1.2 方法

1.2.1 溶菌酶的变性

称取天然溶菌酶固体溶解于变性缓冲溶液中，浓度为10 mg·mL-1,在37℃下保温4 h使溶菌酶彻底变性，置于4℃冰箱中备用。

1.2.2 溶菌酶的复性

取一定量的变性溶菌酶与复性缓冲溶液混合至总体积为3 mL，在37℃下保温24 h，测定酶活性。

1.2.3 复性动力学测定

取所需的变性溶菌酶原液置于250 mL锥形瓶，加入所需的复性缓冲溶液至总体积为100 mL,混合后置于恒温水浴摇床(37℃、60 r·min-1)进行复性。复性过程中定时取样，每次取样量为1 mL,加入100 μL 0.5 mol·L-1碘乙酸作为反应终止剂。实验结束后统一测定样品活性。

1.2.4 溶菌酶活性测定[11]

以微球菌(Micrococcuoslysodeikticus)为底物，用pH值6.2的0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液配制微球菌溶液，调节其在450 nm处的吸光度为1.3，然后取2.5 mL菌液，加入500 μL溶菌酶溶液，测定反应液在450 nm处吸光度的变化，通过吸光度的降低速率来计算溶菌酶的活性。

用复性收率(Yield)表征复性效果。

2 结果与讨论

2.1 L-Arg助溶菌酶复性的最佳条件

2.1.1 溶菌酶浓度的选择

稀释复性过程中的聚集反应是导致复性收率低的首要原因，为减少聚集并促进折叠反应和提高复性收率，通常将蛋白质稀释到很低的浓度(10～50 μg·mL-1)[8]，但同时也限制了它的大规模应用。如复性过程中添加L-Arg，溶菌酶可以在100～500 μg·mL-1浓度范围内保持较高的复性收率。

在复性缓冲溶液中分别添加0 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.6 mol·L-1和0.8 mol·L-1L-Arg，溶菌酶浓度对溶菌酶复性收率的影响见图1。

图1 溶菌酶浓度对溶菌酶复性收率的影响

从图1可以看出，随着溶菌酶浓度的增大，溶菌酶复性收率呈下降趋势；加入L-Arg后，复性收率明显提高。同时，添加L-Arg后，溶菌酶浓度从100 μg·mL-1升至200 μg·mL-1时，复性收率略有下降；但溶菌酶浓度升至250 μg·mL-1后，复性收率急剧下降。在溶菌酶浓度为200 μg·mL-1时，添加0.8 mol·L-1L-Arg时，复性收率可达80%以上；添加0.6 mol·L-1L-Arg时，复性收率也可达80%；当溶菌酶浓度超过300 μg·mL-1时，复性收率均低于50%。因此，确定最佳溶菌酶浓度为200～300 μg·mL-1。

2.1.2 L-Arg浓度的选择

实验发现，不添加L-Arg，溶菌酶浓度即使为100 μg·mL-1，复性体系也会出现大量沉淀，复性收率也很低(低于50%)；添加0.4 mol·L-1L-Arg，溶菌酶浓度为200 μg·mL-1开始出现沉淀；添加0.6 mol·L-1L-Arg，溶菌酶浓度为300 μg·mL-1开始出现沉淀；添加0.8 mol·L-1L-Arg,溶菌酶浓度为500 μg·mL-1时，复性体系也没有出现沉淀。可见添加L-Arg可以在一定程度上抑制复性过程中蛋白聚集。

L-Arg浓度对溶菌酶复性收率的影响见图2。

图2 L-Arg浓度对溶菌酶复性收率的影响

从图2可以看出，随着L-Arg浓度的增大，复性收率先升高后降低，当L-Arg浓度为0.8 mol·L-1时，复性收率最高。因此，确定L-Arg的最佳浓度为0.8 mol·L-1。

2.2 L-Arg助溶菌酶复性过程动力学研究

2.2.1 动力学模型

变性蛋白质的复性动力学通常采用基础三态模型描述，即：

其中：U为变性蛋白；I为中间态蛋白；N为天然态蛋白；A为聚集态蛋白。对变性溶菌酶，由U生成I的过程为快速反应过程，在10～200 ms内完成[11]，故基础三态模型描述的复性反应可进一步简化为从I生成N和A的平行反应。复性动力学方程为：

(1)

(2)

初始条件为：

t=0，cI=cU,0

(3)

式中:kN为复性速率常数；kA为聚集体生成速率常数；n为聚集体生成反应级数；cI为中间态蛋白浓度；cU,0为变性蛋白的初始浓度;cN为天然态蛋白浓度。

Maachupalli-Reddy等[11]在对变性溶菌酶的稀释复性研究中发现，在溶菌酶浓度为0.1～0.6 mg·mL-1范围内，聚集体的生成符合三级反应动力学，即n=3。因此，积分式(1)～(3),得到：

(4)

其中：

(5)

(6)

在溶菌酶浓度为200 μg·mL-1、复性溶液pH值为8.2、添加0.8 mol· L-1L-Arg条件下，研究溶菌酶的复性动力学，结果见图3。

图3 L-Arg助溶菌酶复性动力学曲线

实验数据与式(4)可以较好地拟合，这也与Maachupalli-Reddy等[11]的报道结果一致。拟合得到的速率常数kN=0.0345 min-1、kA=0.265 mL2·mg-2·min-1。与文献[11]报道的速率常数(kN=0.045 min-1、kA=0.728 mL2·mg-2·min-1)对比，添加0.8 mol·L-1L-Arg得到的复性速率常数kN略有减小，但聚集体生成速率常数kA却降低60%多。这也说明添加L-Arg有明显抑制复性蛋白聚集沉淀的作用。

2.2.2 溶菌酶浓度对复性动力学的影响

在复性溶液pH 值为8.2、添加0.8 mol· L-1L-Arg条件下，考察溶菌酶浓度对复性动力学的影响，结果见图4。

图4 添加0.8 mol·L-1L-Arg时，溶菌酶浓度对复性动力学的影响

实验表明，溶菌酶浓度在100～500 μg·mL-1时，添加0.8 mol· L-1L-Arg助溶菌酶复性，其复性动力学实验数据也与式(4)较好地拟合。

在复性溶液pH值为8.2、添加 0.8 mol· L-1L-Arg条件下，溶菌酶复性速率常数kN、聚集体生成速率常数kA及复性收率Yield见表1。

从表1可以看出，在其它复性条件相同的情况下，随着溶菌酶浓度的增大，复性速率常数kN不断下降、蛋白复性收率也不断下降、聚集体生成速率常数kA逐步增大。这意味着随着溶菌酶浓度的增大，复性速率是逐渐降低的，即在复性的初始阶段中间态蛋白生成天然态蛋白的反应速度下降，造成过多的中间态蛋白生成聚集态蛋白，使得聚集体生成速率常数kA增大，聚集态蛋白量相应增大，复性收率也就下降。由此可见，要保持高的复性收率，溶菌酶浓度不能太高，最好不要超过300 μg·mL-1，这也与2.1.1的结果相一致。

表1 溶菌酶浓度对0.8 mol·L-1 L-Arg助溶菌酶复性的 复性速率常数、聚集体生成速率常数、复性收率的影响

2.2.3 L-Arg浓度对复性动力学的影响

在溶菌酶浓度为200 μg·mL-1的条件下，考察L-Arg浓度对复性动力学的影响，结果见图5。

图5 L-Arg浓度对溶菌酶复性动力学的影响

实验表明，溶菌酶浓度为200 μg·mL-1时，添加0～1.0 mol·L-1L-Arg助溶菌酶复性，其复性动力学实验数据也与式(4)能较好地拟合。

在溶菌酶浓度为200 μg·mL-1条件下添加不同浓度L-Arg,溶菌酶复性速率常数kN、聚集体生成速率常数kA及复性收率Yield见表2。

表2 L-Arg浓度对溶菌酶复性的复性速率常数、聚集体生成速率常数、复性收率的影响

从表2可以看出,在溶菌酶浓度不变的情况下,随着L-Arg浓度的增大,溶菌酶复性速率常数kN变化不大,但聚集体生成速率常数kA却显著减小。这说明L-Arg的作用主要是抑制蛋白聚集沉淀，而且L-Arg对蛋白聚集体的抑制作用随着其浓度的增大而不断增强。同时，随着L-Arg浓度的增加，溶菌酶复性速率常数kN先是不断增加，在0.6～0.8 mol·L-1L-Arg范围内相对较高，继续增加L-Arg浓度，复性速率常数kN却不增反降。这表明L-Arg既可以抑制蛋白分子之间的疏水作用，又可以抑制分子内的疏水相互作用，前者抑制蛋白聚集沉淀，后者却抑制蛋白复性，在添加L-Arg浓度低于0.8 mol·L-1时，L-Arg对蛋白分子间疏水作用力的抑制作用强于对分子内疏水作用力，表现为聚集体生成速率常数kA的降低和溶菌酶复性速率常数kN的上升，且kA的降低幅度远大于kN的上升幅度，复性收率Yield不断上升；而L-Arg浓度高于0.8 mol·L-1时，对蛋白分子间疏水作用力的抑制作用却弱于对分子内疏水作用力，表现为kA和kN均降低，但kN降低幅度更大，复性收率Yield下降。因此，添加L-Arg助溶菌酶复性，L-Arg的最适浓度为0.8 mol·L-1，这与2.1.2结果相一致。

3 结论

利用L-Arg助溶菌酶复性时，其最佳的复性条件如下：溶菌酶浓度为200～300 μg·mL-1，添加的L-Arg浓度为0.8 mol·L-1。蛋白质的复性和聚集反应竞争三态动力学模型能较好地描述L-Arg助溶菌酶复性过程。利用该模型分析溶菌酶浓度和添加的L-Arg浓度对复性速率常数kN、聚集体生成速率常数kA以及复性收率Yield的影响，获得了有价值的结果。添加L-Arg助蛋白复性，L-Arg主要是通过抑制蛋白分子间的疏水作用来抑制复性过程蛋白聚集沉淀，从而达到提高复性收率的效果。

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