电刺激对红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇的影响

紫杉醇是红豆杉属(Taxusspp.)植物的次生代谢产物之一，可通过促进微管聚合、抑制微管蛋白解聚来抑制肿瘤细胞的有丝分裂，呈现较强的抗癌活性，尤其对卵巢癌、乳腺癌等有良好的疗效，临床应用广泛。

细胞悬浮培养提供了一种可行的获得紫杉醇的途径，但由于植物细胞生长速度缓慢和产生的有效成分含量低，导致生产成本过高，限制了该技术的广泛应用。因此有必要探索提高悬浮细胞培养产紫杉醇含量的新方法。

电刺激效应对植物愈伤组织的研究始于20世纪80年代[1]。 Rathore等[2]和Goldsworthy等[3]对烟草愈伤组织进行1×10-6A的电流刺激，使生长速率提高70%。王小佳等[4]研究发现0.67×10-6～2.60×10-6A微电流刺激能促进甘蓝 (Brassicaoleraceavar.capitata)愈伤组织分化为芽。250～2000 V的电场脉冲能提高灰大豆、欧洲甜樱桃[5]、小麦[6]、石防风[7]等作物原生质体生活力和植板率。但电刺激对植物悬浮培养细胞的影响还未见报道。

作者研究了脉冲电刺激及微交流电刺激对处于不同生长时期的红豆杉悬浮培养细胞的影响，初步探讨了电流对红豆杉悬浮培养细胞的生长及次生代谢的影响，以探索提高紫杉醇产量的新方法。

1 实验

1.1 材料、培养基及仪器

1.1.1 红豆杉细胞株

来源于中国红豆杉(Taxuschinensis)的疏松愈伤组织传代细胞系，编号C42,自行提供。

1.1.2 培养基

红豆杉细胞液体悬浮培养基为自行优化的MS培养基，简称M62培养基[8]，其中含NAA 0.5 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1、2,4-D 0.08 mg·L-1。

1.1.3 仪器

电极材料为直径1 mm的不锈钢丝，电极长5.7 cm、宽0.6 cm，两电极相距2 cm。电极固定在两片薄塑料片(可耐高温、高压，在培养基中不发生任何变化)上，一端引出两条耐高温灭菌的绝缘导线与仪器的正负极连接，置于250 mL三角瓶中灭菌待用。

Gilson型高效液相色谱系统，Waters型高效液相色谱系统。

脉冲电刺激仪器：G6805型治疗仪，上海医疗器械高技术公司；微交流电刺激仪器：FJ-XD11PS型多用信号发生器，埠阳市应用技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞悬浮培养

将M62液体培养基分装到置有电极的250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121℃ 高压灭菌25 min。细胞鲜重接种量为10%(质量体积比)，于25℃、光照10 h·d-1、120 r·min-1培养。

1.2.2 脉冲电刺激处理红豆杉悬浮培养细胞

1.2.2.1 脉冲电刺激参数

脉冲波频率为100 Hz，即每秒100次；周期10 ms；总峰宽1.56 ms;电场强度25 V·cm-1、75 V·cm-1、125 V·cm-1、175 V·cm-1；刺激时间1 h、3 h、5 h、7 h。

1.2.2.2 不同强度脉冲电刺激处理

红豆杉悬浮培养细胞生长至第7 d、20 d时，将细胞分为五组，一组为对照组，不进行任何处理；另外四组分别进行不同强度的脉冲电刺激，刺激时间均为3 h，刺激强度分别为25 V·cm-1、75 V·cm-1、125 V·cm-1、175 V·cm-1。研究不同刺激强度下，进行3 h脉冲电刺激处理对红豆杉细胞的影响。

1.2.2.3 不同时间脉冲电刺激处理

红豆杉悬浮培养细胞生长至第7 d、20 d时，将细胞分为五组，一组为对照组，不进行任何处理；另外四组分别进行不同时间的脉冲电刺激，刺激强度均为175 V·cm-1，刺激时间分别为1 h、3 h、5 h、7 h。研究不同时间脉冲电刺激处理对红豆杉细胞的影响。

1.2.3 微交流电刺激处理红豆杉悬浮培养细胞

在红豆杉悬浮培养细胞生长的第0 d、7 d、14 d、21 d、28 d，对其进行微交流电刺激，刺激时间为7 d，刺激电流为50 Hz的正弦交流电(用数字示波器测得其峰值为16.6 V，计算其平均有效电压为5.8 V)。通过串加不同的电阻，获得不同强度的刺激电流，分别为18 μA、36 μA、72 μA、126 μA。

1.2.4 细胞生物量的测定

细胞悬浮培养28 d后，收获细胞并减压抽滤，称量细胞质量即为细胞的鲜重(FW)；将细胞置于冷冻干燥器中干燥后，其质量为细胞的干重(DW)。

1.2.5 细胞内紫杉醇含量的测定

准确称取冷冻干燥后细胞100 mg，充分研磨，每次加入3 mL甲醇重复浸提，合并浸提液并减压抽干，加入氯仿∶水(2∶8)10 mL萃取3次，取氯仿相，减压除去氯仿，浸膏用1 mL甲醇定容，HPLC测定紫杉醇含量(以每升培养基中紫杉醇的毫克数表示)。

1.2.6 培养液中紫杉醇含量的测定

取经过抽滤后的细胞培养液20 mL，加入氯仿∶甲醇(1∶1)5 mL，振荡均匀，静置后离心，取氯仿相，重复2次，减压除去氯仿，残留物质用1 mL甲醇定容，HPLC测定紫杉醇含量(以每升培养基中紫杉醇的毫克数表示)。

1.2.7 紫杉醇胞外释放率的计算

2 结果与讨论

2.1 脉冲电刺激对红豆杉悬浮培养细胞生长及产紫杉醇的影响

2.1.1 第7 d脉冲电刺激对红豆杉悬浮培养细胞生长及产紫杉醇的影响(图1)

1#.3 h、25 V·cm-1 2#.3 h、75 V·cm-1 3#.3 h、125 V·cm-1 4#.3 h、175 V·cm-1 5#.1 h、175 V·cm-1 6#.3 h、175 V·cm-1 7#.5 h、175 V·cm-1 8#.7 h、175 V·cm-1

由图1可知，细胞生长第7 d经脉冲电刺激处理后，细胞生物量和紫杉醇含量比对照都有所增加。其中以3 h、175 V·cm-1(4#和6#处理组)处理促进了紫杉醇的产生，含量达到2.82 mg·L-1，是对照的2倍多。

2.1.2 第7 d脉冲电刺激对红豆杉悬浮培养细胞紫杉醇释放的影响(表1)

表1 第7 d脉冲电刺激后紫杉醇的胞外释放率

从表1可以看出，175 V·cm-1下脉冲电刺激处理7 h效果明显，胞外释放率达到41%左右，是对照的4.3倍左右。这可能是因为，脉冲电刺激处理使红豆杉细胞膜相对透性增大，细胞渗透率提高，不但利于紫杉醇的释放，也增强了对液体培养基中营养物质的利用，经适宜剂量的脉冲电处理后，红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇由非分泌型转化为分泌型。

2.1.3 第20 d脉冲电刺激对红豆杉细胞生长及产紫杉醇的影响(图2)

1#.3 h、25 V·cm-1 2#.3 h、75 V·cm-1 3#.3 h、125 V·cm-1 4#.3 h、175 V·cm-1 5#.1 h、175 V·cm-1 6#.3 h、175 V·cm-1 7#.5 h、175 V·cm-1 8#.7 h、175 V·cm-1

由图2可以看出，各处理组的紫杉醇含量均远远高出对照，其中2#、3#、4#、6#处理组细胞紫杉醇含量提高最大，是对照的7～9倍，最高达到12.24 mg·L-1。

2.1.4 第20 d脉冲电刺激对红豆杉悬浮培养细胞紫杉醇释放的影响(表2)

表2 第20 d脉冲电刺激后紫杉醇的胞外释放率

从表2可以看出，细胞生长到第20 d时进行脉冲电刺激，不同处理均明显提高了红豆杉悬浮培养细胞的紫杉醇胞外释放率，最高可达43%左右，是对照的4.4倍左右，与第7 d相应处理细胞的胞外释放率类似。

2.2 微交流电刺激对红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇的影响(图3)

图3 微交流电刺激后红豆杉悬浮培养细胞的紫杉醇含量

由图3可以看出，在细胞生长的不同时期对细胞进行微交流电刺激，当电流强度低于18 μA时，红豆杉细胞紫杉醇的含量受电流强度的影响不明显；当电流强度高于18 μA时，紫杉醇的含量明显增加，并且不同生长时期微交流电的最佳处理强度不同。在细胞生长的衰亡期(21～28 d)进行微交流电刺激可以大幅提高紫杉醇的含量，最高达5.7 mg·L-1，较未处理细胞提高3倍多。

2.3 讨论

目前对电刺激效应机制的认识还处于假说阶段，完整的实验证据较少，由于所选用的实验材料和实验体系不同，各作者的观点和侧重点也不尽相同。就原生质体而言，电刺激的作用可从两方面考虑，一方面电刺激可能会改变原生质体结构和成分，Ca2+学说认为[3,9]：Ca2+从细胞生长旺盛的一极流入，停留在细胞生长的部位以活化促进生长的酶。另一方面电刺激能改变质膜的渗透性，增强对培养基中各种成分的吸收，导致内源生长激素增加，原生质体生长和分裂加快。对器官培养来说[10,11]，电流促进芽分化的实验说明电控制组织培养中细胞的极性，外加电流通过恢复和加强细胞极性的共调节作用诱导组织中的器官发生。

本实验中，在红豆杉细胞对数生长期和稳定期，经两种电刺激处理后的细胞生物量明显提高，与对照相比，颜色明亮，细胞呈细粉状，分散性较好，推测是由于细胞与液体培养基的有效接触面积增大，有利于细胞吸收培养基中营养物质及进行物质能量的交换，从而促进了细胞的生长；紫杉醇胞外释放率的提高也说明电刺激增加了细胞质膜的通透性。后续实验将对电流处理后细胞的相关生理生化指标进行进一步的研究，以明确电刺激对红豆杉悬浮培养细胞作用的机理。

3 结论

采用脉冲电刺激和微交流电刺激均可促进红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇，最佳作用时间是在红豆杉细胞生长的衰亡期，微交流电刺激可使紫杉醇含量提高3倍多，而脉冲电刺激处理组则是对照的7～9倍，最高达到12.24 mg·L-1。说明脉冲电刺激对于促进红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇更有效。本实验所用的细胞系属于非分泌型，经测定培养基中紫杉醇的含量表明，脉冲电刺激可有效提高紫杉醇的胞外释放率，是对照的4～5倍。

参考文献：

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