己酮可可碱对染汞大鼠脊髓及背根神经节TNF-α表达的影响*

张 军，周永田，徐旭东，谢 林，李 娟，徐明怡

（1.山东省医药工业设计院，山东 济南 250013；2.山东省职业卫生和职业医学院，山东 济南 250002）

近年的研究显示，许多汞中毒患者出现的长期、剧烈、自发性肌肉刺痛或烧灼痛，以下肢为主，常伴有患肢麻木和痛觉过敏，肌电图显示神经传导速度减慢[1，2]。目前临床治疗汞中毒主要应用螯合剂驱汞，辅以对症治疗，对汞中毒疼痛缺乏有效治疗措施。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），由激活的单核-巨噬细胞分泌，主要合成部位在背根神经节（DRG）的大、中型细胞[3]。TNF-α广泛分布于中枢、周围神经系统，具有多种生理功能。研究表明，TNF-α与神经病理性疼痛的产生及其持续状态有密切关系[4]。为探讨汞中毒疼痛发病机制及有效治疗方法，笔者观察了氯化汞和己酮可可碱对大鼠脊髓和DRG中TNF-α的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

实验用HgCl2（上海化学试剂总厂，生产批号为990402），二巯丙磺纳注射液（DMPS，上海禾丰制药有限公司，生产批号为0309011），己酮可可碱缓释片（pentoxifylline，POF）（德国 Merckle GmbH 药业公司产品，生产批号为C20571）；TNF-α检测试剂盒（武汉博生微生物工程有限公司，生产编号为SA1025）。

1.2 动物

健康雄性清洁级SD大鼠40只，体重180～220 g，（上海希蒲尔必凯实验动物有限公司），动物质量合格证号为SCXK（沪）2003-0002，本院动物房饲养，室内温度19～24℃，相对湿度40%～70%，自由摄食饮水。

1.3 分组染汞

将动物随机分为7组；对照组（10只）经口灌胃生理盐水（NS）2 mL，1次 /d；A、B、C组（各 5只）按17 mg/kg（1/4LD50）；D、E、F 组（各 5 只）按 8.5 mg/kg（1/8LD50），经口灌胃HgCl2溶液，1次/d。7组均连续灌胃18～22 d。染毒组超过50%的动物出现中毒症状（动物出现步态不稳，行动障碍或痉挛）[5]后停止染汞。疼痛判断标准：动物出现抓舔肢体、甩尾、嘶叫、翻身、转圈等表现[6]。

1.4 药物干预

50%的动物出现中毒症状后，处死对照组5只大鼠和A、D组大鼠，剩余染汞大鼠作药物干预实验。B、E组大鼠用DMPS按28 mg/kg腹腔注射驱汞2个疗程（每天1次，驱汞3 d，休息4 d为1个疗程），C组大鼠用DMPS+POF（按29.22 mg/kg经口灌胃，每天1次，共14 d）；F组和对照组5只大鼠腹腔注射NS 1 mL/次，方法同DMPS。实验结束后处死全部动物。

1.5 获取标本

用1%戊巴比妥钠按40 mg/kg腔腹注射麻醉动物，随后将其固定于解剖台上，剖胸做心脏穿刺，将针头固定于升主动脉，先灌注NS约150 mL，再灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4）约200 mL，待动物僵硬后取出脊髓L5-6节段和两侧L5、L6背根神经节（DRG），置于10%的甲醛磷酸缓冲液中固定，按常规制成病理切片，片厚15μm。

1.6 检测指标

用免疫组织化学链酶亲和素-生物素-过氧化物酶聚合物法[7]（SABC）测定DRG及脊髓TNF-α，严格按照试剂盒说明书要求操作。

1.7 图像分析

用400倍光学显微镜观察切片，并将图像通过摄像头转入计算机图像分析系统，用LEICA QWIN V3图像分析软件对病理切片进行分析。每个DRG取5张连续切片，随机选取上、下、左、右、中5个互不重叠的视野；每个L5-6脊髓阶段连续取5张切片，在脊髓背角Ⅰ层和Ⅱ层细胞取5个互不重叠的视野，计算免疫阳性物的平均灰度和平均面积。

1.8 统计学分析

用SPSS10.0软件，采用Homogeneity-of-variance首先对资料进行方差齐性检验。若方差齐性，单因素方差分析（One-way ANOVA）并采用Dun-nett-test进行染毒组与对照组均数间两两比较；方差不齐时，用Kruskal-Wallis test非参数统计，用Mann-Whitney test进行均数间两两比较。以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物染毒与中毒表现

A、B、C（17 mg/kg）组大鼠于染汞第 12 天时开始出现口腔流涎，口腔出现血性分泌物，精神萎靡，活动减少，步态僵硬、笨拙，皮毛粗糙，尿量增多，大便稀。染汞第19天有9只大鼠出现汞中毒表现，停止染汞。汞中毒大鼠中有1只于染汞第17天出现疼痛表现；该大鼠不停的舔、抓双下肢、双后脚和尾部，致使该部位出现红肿，甚至部分皮肤破损，该大鼠并未受伤，故判断为汞中毒疼痛。药物干预实验结束时该大鼠仍有疼痛表现。D、E、F（8.5 mg/kg）组大鼠于第16天开始出现口腔流涎，口腔有血性分泌物，活动减少，步态笨拙，精神倦怠，皮毛粗糙，尿量增多，大便稀。于第22天有8只大鼠出现汞中毒表现，停止染汞。无疼痛大鼠出现。对照组大鼠全部正常生存。

2.2 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度与阳性反应物平均面积

表1可见，驱汞前各染汞组大鼠脊髓TNF-a平均灰度均显著低于对照组，平均面积均显著大于对照组（P＜0.05）；驱汞 14 d后，B、E、F组 TNF-a表达仍显著强于对照组；C与B组相比，TNF-α灰度显著提高，平均面积显著减少（P＜0.05），已接近对照组水平。

2.3 汞中毒大鼠背根神经节TNF-α平均灰度与阳性反应物平均面积

表2可见，驱汞前各染汞组大鼠背根神经节TNF-α平均灰度均显著低于对照组，平均面积均显著大于对照组（P＜0.05）。驱汞 14 d后，B、E、F组TNF-α平均灰度有所升高，平均面积有所减小，但与对照组相比，仍有显著差异。C组与B组相比，TNF-α平均灰度显著升高，平均面积显著减少（P＜0.05），已接近对照组水平。

表1 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度与阳性反应物平均面积 （n=5，）

表1 汞中毒大鼠脊髓TNF-α平均灰度与阳性反应物平均面积 （n=5，）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与B组相比，P＜0.05

组别 驱汞前驱汞后平均灰度 平均面积 平均灰度 平均面积对照组 212.93±21.03 3211.56±48.29 267.19±23.57 2917.58±55.81 A组（高Hg） 113.75±4.211） 4937.13±77.031） - -B组（高 Hg+DMPS） 92.56±3.821） 4855.01±82.691） 115.33±18.321） 4407.12±31.451）C组（高Hg+DMPS+己） 99.02±8.211） 5014.05±57.621） 177.63±12.792） 2991.32±29.712）D组（低Hg） 137.53±5.371） 4671.55±77.351） - -E 组（低 Hg+DMPS） 122.65±5.291） 4408.93±47.051） 152.71±11.061） 3851.07±25.991）F 组（低 Hg+NS） 135.66±4.371） 4502.31±54.081） 142.69±11.871） 3908.16±72.191）

表2 汞中毒大鼠背根神经节TNF-α平均灰度与阳性反应物平均面积 （n=20，）

表2 汞中毒大鼠背根神经节TNF-α平均灰度与阳性反应物平均面积 （n=20，）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与B组相比，P＜0.05

驱汞后平均灰度 平均面积 平均灰度 平均面积对照组 237.19±7.64 3418.35±67.22 261.27±8.83 3710.47±25.59 A组（高Hg） 116.96±7.261） 5920.48±28.191） - -B组（高 Hg+DMPS） 105.62±7.291） 5671.95±38.271） 131.43±5.771） 4992.73±62.191）C组（高Hg+DMPS+己） 113.28±7.281） 5723.91±62.191） 241.69±7.182） 4012.16±26.972）D组（低Hg） 106.55±4.981） 5594.24±49.381） - -E 组（低 Hg+DMPS） 116.27±7.331） 5829.84±56.381） 144.36±14.311） 4211.06±38.951）F 组（低 Hg+NS） 120.03±6.221） 5891.05±52.181） 142.52±12.071） 3990.35±51.071）组别 驱汞前

3 讨论

本实验结果表明，亚急性汞中毒大鼠脊髓后角和背根神经节TNF-α表达水平显著高于对照组，而且用DMPS驱汞14 d后仍未见TNF-α表达显著减弱，说明单纯用DMPS驱汞并不能抑制TNF-α 表达。17 mg/kg染汞（B、C）组和 8.5 mg/kg染汞（E、F）组之间TNF-α平均灰度和平均面积差异均无统计学意义，未见到剂量-效应关系，这可能与两染汞组之间剂量相距较近有关。

TNF-α是一种前炎性细胞因子，有多种生物学效应，与神经病理性疼痛的产生和持续存在有密切关系。研究发现，TNF-α不仅有单核-巨噬细胞产生，而且也可以由神经细胞和胶质细胞产生[8]。当机体处于受伤、感染、免疫功能异常等多种病理状态时，中枢的胶质细胞就会被激活，释放出IL-1、IL-6、TNF-α及NGF等多种细胞因子以及兴奋性氨基酸、NO等神经递质，它们一方面作用于痛觉神经元，使其兴奋性增强，向高级中枢传递疼痛信号，另一方面降低神经元的兴奋阈值，造成中枢敏化，使许多无效阈下神经冲动变为有效阈上神经刺激，使疼痛信号传递的频率和幅度大为提高。同时，这些细胞因子还可以作用于胶质细胞，产生正反馈作用，进一步增加细胞因子的数量，形成瀑布效应，从而形成了神经病理性疼痛的持续状态[9]。

己酮可可碱是黄嘌呤代谢产物，有扩张脑和周围血管的作用，可以改善脑和四肢的血液循环。近期研究发现，它还有抑制中枢胶质细胞激活和抑制TNF-α产生的作用[10]。本文的实验结果与他们的结论一致，说明己酮可可碱有可能在汞中毒疼痛的治疗中，发挥积极作用。

[1]VAMNES JS,LYGRE GB,GRONNINGSAETER AG,et al.Four years of clinical experience with an adverse reaction unit for dental biomaterials[J].Community dent oral epidemiol,2004,32(2):150-157.

[2]GUO GX,LIU XT.The clinical analysis of 20 cases with leg pain induced by Mercury poisoning[J].Henan Journal of Preventive Medicine,2003,14(4):253-254.Chinese

[3]SCHAFERS M,GEIS C,BRORS D,et a1.Anterograde transport of tumor necrosis factor-alpha in the intact and injured rat sciatic nerve[J].J Neurosci,2002,22(2):536-545.

[4]BARON R.Peripheral neuropathic pain:from mechanisms to symptoms[J].Clin J Pain,20O0,16(2 Supp1):S12-20.

[5]CAO BZ,CHANG GF,CAO X,et al.The pathology evolution of peripheral nerve damage induced by chlorination methyl mercury[J].Academic Journal of Second Military Medical University,2004,25(11):1190-1194.Chinese

[6]JIANG DC,ZHAO ZQ,JIANG H.The foundation and clinical of pain[M].Shanghai:Fudan Uiversity Press,2001:1-7.Chinese

[7]WANG LL,LIU YH,LI SQ,et al.Clinical immunology and Immunity examination[M].The 5th edition.Beijing:People's Medical Publishing House,2003:53-243.Chinese

[8]ZHOU ZC,YAO SL,ZHANG YF,et al.Effect of Intrathecal Injection with Etanercept on Incisional Pain and Expression of Spinal Tumor Necrosis Factor-alpha in Rats[J].Acta Med Univ Sci Technol Huazhong,2008,37(4):460-464.Chinese

[9]YANG JL,LIU JY.Research development on neuropathic pain[J].Journal of Yunyang Medical College,2005,24(2):121-122.Chinese

[10]YANG Y,WANG YJ,SHI Q.The pain of never root and TNF-α[J].Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology and Orthopedics,2002,10(1):61-63.Chinese